馬 莉 ， 榮 芳△， 王建賓， 張年萍， 劉 宏

(山西大同大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系， 2呼吸病與職業(yè)病研究所， 山西 大同 037009)

白血病是一種血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且預(yù)后情況較差[1-2]。目前，多藥物聯(lián)合化療仍是治療白血病的重要手段[3]。香菇提取物，例如香菇多糖(lentinan)，已被證實(shí)對癌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的活性[4]。香菇多糖屬于免疫激活性多糖，是一種腫瘤臨床治療藥物，可提高腫瘤患者的免疫力[5]。研究表明，一些天然植物提取物可通過抑制白血病細(xì)胞中的信號通路來抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-10]，其中，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。多項(xiàng)研究表明，白血病細(xì)胞中存在PI3K/AKT信號通路的持續(xù)活化[11-13]。因此，本實(shí)驗(yàn)以人急性髓系白血病HL-60細(xì)胞為研究對象，檢測香菇多糖對其凋亡的影響，并檢測與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，為闡明香菇多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

香菇多糖購自日本味之素株式會社(每支1 mg)；HL-60細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；RPMI-1640培養(yǎng)液購自GIBCO；胎牛血清購自浙江四季青生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素、總蛋白提取試劑盒和胞漿蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；MTT、Annexin V/PI凋亡試劑盒及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；兔抗人PI3K、Akt和p-Akt單抗購自Cell Signaling；鼠抗人GAPDH單抗購自Santa Cruz；PI3K抑制劑LY294002購自碧云天生物基因技術(shù)公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下，培養(yǎng)于含有10%滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，每隔1～2 d換液傳代1次，選對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測香菇多糖對HL-60細(xì)胞活力的影響 離心收集對數(shù)期、形態(tài)生長良好的HL-60細(xì)胞，接種于含RPMI-1640培養(yǎng)液的96孔板上(終濃度為2.0×107～2.5×107/L)，每孔100 μL。同時加入香菇多糖，使其濃度為15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L(分別記為15 mg/L lentinan組、30 mg/L lentinan組和45 mg/L lentinan組)，對照組加入相應(yīng)體積的滅菌生理鹽水(記為0 mg/L lentinan組)，每個濃度設(shè)8個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入MTT(5 g/L)，每孔10 μL，4 h后加入DMSO，酶標(biāo)儀測量各個時點(diǎn)490 nm處吸光度(A)值。重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

2.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測香菇多糖及PI3K通路抑制劑LY294002對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 分別收集濃度為0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L香菇多糖(分別記為0 mg/L lentinan組、15 mg/L lentinan組、30 mg/L lentinan組和45 mg/L lentinan組)及5 mg/L LY294002(記為LY294002組，control組為0 mg/L LY294002處理組，即加入等體積的滅菌生理鹽水)處理72 h的HL-60細(xì)胞懸液，離心去上清，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混勻，避光室溫孵育15 min。加入400 μL結(jié)合緩沖液，轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃管，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，檢測結(jié)果使用CellQuest軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。[注：我們前期實(shí)驗(yàn)得出，LY294002對人白血病細(xì)胞HL-60的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為1.4 μmol/L(處理時間為72 h)，故用5 mg/L LY294002處理HL-60白血病細(xì)胞。]

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 參照試劑盒說明書步驟分別提取經(jīng)30 mg/L香菇多糖作用后0 h、24 h、48 h和72 h的HL-60細(xì)胞的總蛋白和胞漿蛋白(分別記為0 h組、24 h組、48 h組和72 h組)，并以BCA法對總蛋白定量。將蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)膜。取PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。加入1 500倍稀釋的抗cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cytochrome C、β-actin、PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH抗體于4 ℃下孵育24 h。經(jīng)封閉液洗滌后，加入1 5 000倍細(xì)胞的II抗于37 ℃下孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較使用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 香菇多糖可抑制HL-60細(xì)胞的活力

與0 mg/L lentinan組相比，HL-60細(xì)胞經(jīng)香菇多糖處理后，細(xì)胞活力受到抑制。處理后24 h、48 h和72 h，香菇多糖均能以濃度依賴性的方式抑制細(xì)胞活力；15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L香菇多糖處理均能以時間依賴性的方式抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度的香菇多糖在處理不同時間對HL-60細(xì)胞活力抑制率的影響

Table 1. The effects of lentinan at different concentrations for different time on the viability inhibitory rate of HL-60 cells (%.Mean±SD.n=3)

Group24 h48 h72 h0 mg/L lentinan0.000.000.0015 mg/L lentinan18.65±3.25*25.24±2.68*#30.26±3.46*#30 mg/L lentinan25.58±2.32*36.67±2.88*#48.85±3.97*#45 mg/L lentinan30.89±3.59*46.27±4.02*#60.85±4.15*#

*P<0.05vs0 mg/L lentinan group;#P<0.05vs24 h group.

2 香菇多糖促進(jìn)HL-60細(xì)胞的凋亡

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L)香菇多糖處理72 h后的凋亡情況。與0 mg/L lentinan組相比，隨著香菇多糖濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增多逐漸增加(P<0.05)，見圖1。這說明香菇多糖促進(jìn)HL-60白血病細(xì)胞的凋亡。

Figure 1. The effects of lentinan at different concentrations on the apoptosis of HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L lentinan group.

圖1 不同濃度香菇多糖對HL-60細(xì)胞凋亡的影響

3 香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程PARP剪切增加

MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)香菇多糖對人白血病細(xì)胞HL-60的IC50約為30 mg/L(處理時間為72 h)，故用30 mg/L香菇多糖處理HL-60白血病細(xì)胞。處理過后，利用Western blot檢測香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中cleaved PARP蛋白的水平。結(jié)果顯示與0 h組相比，cleaved PARP蛋白的表達(dá)水平隨著處理時間的增長明顯升高(P<0.05)，見圖2。這證明香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中PARP剪切增加。

Figure 2. The protein level of cleaved PARP during apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖2 香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中cleaved PARP蛋白水平的變化

4 香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中caspase-9和caspase-3激活

HL-60細(xì)胞經(jīng)30 mg/L香菇多糖處理后，Wes-tern blot檢測香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與0 h組相比，cleaved caspase-9和cleaved caspase 3的蛋白水平隨著處理時間的增長明顯升高(P<0.05)，而cleaved caspase-8變化的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3. The protein levels of cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 during the apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖3 香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平的變化

5 香菇多糖誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡是線粒體cytochrome C的釋放介導(dǎo)的

HL-60白血病細(xì)胞經(jīng)30 mg/L香菇多糖處理后，Western blot檢測香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中胞漿中cytochrome C的蛋白水平。結(jié)果表明，與0 h組相比，cytochrome C的蛋白水平隨著處理時間的增長明顯升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The protein level of cytochrome C during the apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖4 香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中cytochrome C蛋白水平的變化

6 香菇多糖對HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響

HL-60細(xì)胞經(jīng)不同濃度香菇多糖處理72 h后，Western blot檢測香菇多糖對HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響。結(jié)果顯示，與0 mg/L lentinan組相比，PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平隨著香菇多糖濃度的增加明顯降低(P<0.05)，見圖5。這說明香菇多糖誘導(dǎo)的HL-60白血病細(xì)胞凋亡過程中PI3K/AKT信號通路被抑制。

Figure 5. The effects of lentinan at different concentrations on the protein levels of PI3K/AKT signaling pathway-related molecules in the HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖5 不同濃度香菇多糖對HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響

7 PI3K通路抑制劑LY294002 誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞經(jīng)5 mg/L LY294002處理72 h后的凋亡情況。與control組相比，PI3K抑制劑LY294002促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. The effects of PI3K inhibitor LY294002 on the apoptosis of HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 PI3K通路抑制劑LY294002對HL-60細(xì)胞凋亡的影響

討 論

據(jù)估算，全球每年有14萬左右的人被診斷為白血病，大多數(shù)為急性白血病，是我國十大高發(fā)惡性腫瘤之一[13-14]。多藥物聯(lián)合化療是臨床上治療白血病最常規(guī)的方式，但是，受到化療藥物耐受以及不良反應(yīng)等因素的影響，白血病的整體療效及預(yù)后情況并不理想。因此，探尋不同作用機(jī)制的藥物來與常規(guī)化療藥物聯(lián)合治療白血病是臨床研究的重要內(nèi)容[15]。

多糖是生物體內(nèi)的重要組成成分，具有多種生理功能，如增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老和降血糖等[4]。香菇多糖分子主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖等組成[16]。目前香菇多糖可應(yīng)用于臨床，通過提高機(jī)體的免疫力，作為輔助藥物配合胃癌患者的化療[17]。當(dāng)前的研究成果雖未闡明香菇多糖抗腫瘤特性的具體機(jī)制，但是，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種可能的機(jī)制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖對HL-60細(xì)胞的活力有抑制作用，并且這種抑制具有濃度依賴性和時間依賴性。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生途徑主要包括死亡受體介導(dǎo)的外部凋亡途徑、內(nèi)部線粒體途徑、顆粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑等。其中，內(nèi)部線粒體途徑是由cytochrome C釋放介導(dǎo)的。Caspase-9被激活后，啟動了caspase-3在內(nèi)的caspase級聯(lián)反應(yīng)過程，cytochrome C從線粒體內(nèi)膜釋放到胞漿中[19]。本研究表明，香菇多糖可通過誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制其生長的效果。在香菇多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過程中caspase-9和caspase-3被激活，cleaved caspase-8的蛋白水平?jīng)]有變化，且cytochrome C的蛋白水平隨著處理時間的增長明顯升高。說明香菇多糖是通過線粒體途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病等細(xì)胞增殖及凋亡方面起關(guān)鍵作用；AKT是PI3K重要的下游分子，活化的AKT可使caspase-9磷酸化而失活，從而抑制細(xì)胞的線粒體凋亡途徑[20-21]。PI3K/AKT信號通路在白血病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，該通路的激活受到抑制后，能夠直接調(diào)控白血病細(xì)胞的凋亡過程[22-24]。本研究通過檢測香菇多糖處理后HL-60細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT和p-AKT等蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，香菇多糖以濃度依賴性的方式抑制上述3種蛋白的水平，從而使PI3K/AKT信號通路受阻。為了明確使用PI3K/AKT信號通路受到抑制后是否能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，我們利用PI3K通路抑制劑LY294002處理HL-60細(xì)胞。對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，且與香菇多糖處理效果類似，說明PI3K/AKT信號通路的活化受到抑制后，可直接調(diào)控HL-60細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們推測香菇多糖可通過抑制PI3K/AKT信號通路來誘導(dǎo)HL-60白血病細(xì)胞凋亡。