沈 強(qiáng),劉永定,李敦海,李嗣新

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白鰱羅非魚(yú)對(duì)微囊藻毒素急性、亞急性毒性響應(yīng)

沈 強(qiáng)1*,劉永定2,李敦海2,李嗣新1

(1.水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所,水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430079；2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,湖北 武漢 430072)

為了探究不同控藻魚(yú)類(lèi)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻的適應(yīng)機(jī)制,為生物操縱的魚(yú)種選擇提供依據(jù),研究了白鰱和羅非魚(yú)對(duì)微囊藻毒素(MC)的生物富集、降解,及兩種魚(yú)對(duì)毒素的抗性、解毒機(jī)制的差異性.結(jié)果發(fā)現(xiàn):在喂食微囊藻實(shí)驗(yàn)中,白鰱、羅非魚(yú)對(duì)MC日攝入量達(dá)到10mg/kg,2種魚(yú)均對(duì)MC有較強(qiáng)抗性.微囊藻經(jīng)魚(yú)攝入后,MC總含量在白鰱、羅非魚(yú)糞便中分別下降到71.5%、6.0%,羅非魚(yú)對(duì)MC降解能力遠(yuǎn)高于白鰱.白鰱和羅非魚(yú)的肝系數(shù)分別從(1.19±0.21)%、(2.24±0.19)%下降到(0.79±0.06)%、(1.72±0.07)%,均表現(xiàn)出顯著差異性下降(<0.05).微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉中積累量分別為(1.57±0.31)μg/kg、(10.81±6.52)μg/kg(鮮重)、肝臟中積累量分別為(4.28±1.64)mg/kg、(2.48±0.15)mg/kg(鮮重).MC在白鰱、羅非魚(yú)肌肉、肝臟中的積累量均存在顯著差異性(<0.05).羅非魚(yú)肌肉中毒素含量是白鰱的6.9倍.在微囊藻毒素LR(MC-LR)對(duì)白鰱和羅非魚(yú)的急性毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,MC-LR對(duì)白鰱、羅非魚(yú)的LD50為270和790μg/kg,羅非魚(yú)對(duì)毒素有更強(qiáng)耐受性.喂食毒藻和i.p.注射MC均導(dǎo)致白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴大量出現(xiàn).2種魚(yú)在MC-LR注射后,谷胱甘肽(GSH)含量均表現(xiàn)出6h內(nèi)明顯下降.6h后兩種魚(yú)GSH含量均逐步回升,二者差異顯著(<0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,羅非魚(yú)對(duì)MC降解能力遠(yuǎn)高于白鰱.白鰱主要攝食群體微囊藻的群體膠鞘和附著細(xì)菌,胞內(nèi)微囊藻毒素釋放量小,白鰱這種攝食機(jī)制導(dǎo)致它能以產(chǎn)毒微囊藻為食而受到較輕危害.羅非魚(yú)體內(nèi)消化酶對(duì)微囊藻和MC具較強(qiáng)的消化降解能力;GSH含量及相關(guān)酶活性水平高,對(duì)體內(nèi)毒素清除效率高.從食用安全性角度出發(fā),與羅非魚(yú)相比,白鰱是更適合用于控制藍(lán)藻水華的魚(yú)種,可廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻水華控制中.

有害藻類(lèi)水華；微囊藻毒素；白鰱；羅非魚(yú)；抗性機(jī)制

湖泊水體富營(yíng)養(yǎng)化引起的藻類(lèi)水華已成為世界范圍重大環(huán)境污染問(wèn)題之一.在我國(guó),不少大型淺水湖泊在每年夏秋季節(jié)均有大量藍(lán)藻水華形成,如太湖[1-2],巢湖[3-4]和滇池[5-6].其中大多數(shù)水華以微囊藻水華為主.微囊藻細(xì)胞通常呈球形,天然情況下多為群體形態(tài),在藻細(xì)胞破裂時(shí)釋放出大量毒素,即微囊藻毒素(MC).目前已發(fā)現(xiàn)100種以上微囊藻毒素變體[7],微囊藻毒素能夠作用于蛋白磷酸酶,使蛋白磷酸化失調(diào),增加活性氧(ROS)形成而具有肝臟毒性[8].微囊藻毒素給多種動(dòng)植物帶來(lái)危害,包括農(nóng)作物[9-11],水生植物[12],浮游動(dòng)物[13],魚(yú)類(lèi)[14-15],野生動(dòng)物,家畜,鳥(niǎo)類(lèi)[16-17]和人類(lèi)[18]等,甚至導(dǎo)致其死亡.藻類(lèi)水華及其所產(chǎn)生的毒素成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn) 題.

研究表明,與哺乳動(dòng)物相比,魚(yú)類(lèi)對(duì)微囊藻毒素的耐受性較強(qiáng),某些魚(yú)類(lèi)如白鰱,花鰱和羅非魚(yú)等對(duì)微囊藻毒素有一定抗性[19-20].這些魚(yú)類(lèi)常被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外湖泊水庫(kù)中控制藍(lán)藻水華[21-23].控藻魚(yú)類(lèi)以產(chǎn)毒微囊藻為食物,并能與之長(zhǎng)期共存,但其生理適應(yīng)機(jī)制尚不完全清楚.因此,本文選取國(guó)內(nèi)外2種常見(jiàn)的控藻魚(yú)類(lèi)白鰱、羅非魚(yú)為研究對(duì)象,研究微藻藻毒素對(duì)2種魚(yú)類(lèi)的亞急性和急性毒性效應(yīng),探討不同控藻魚(yú)類(lèi)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻在生理生化上的解毒機(jī)制,為今后生物操縱的魚(yú)種優(yōu)選及水華污染控制方面提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

微囊藻水華采集:在武漢市郊某一水華頻發(fā)的魚(yú)塘,使用孔徑60μm浮游生物網(wǎng)采集藻類(lèi)水華樣品.經(jīng)顯微鏡檢測(cè),水華中銅綠微囊藻()為主要種類(lèi),優(yōu)勢(shì)度>98%.采集的水華除去雜物、蒸餾水清洗后,再次用孔徑60μm浮游生物網(wǎng)濃縮成濃藻漿,測(cè)定藻漿含水量,4℃下備用.初步純化的濃藻漿用于亞急性實(shí)驗(yàn).

微囊藻毒素制備:以采集的產(chǎn)毒微囊藻水華為原料制備.毒素提取方法參照文獻(xiàn)[24-25],毒素提取物用制備型HPLC純化,收集毒素出峰中段,反復(fù)制備2次,得到MC-LR純品(色譜純度>93%).純化后的MC-LR用于急性毒性實(shí)驗(yàn).

實(shí)驗(yàn)魚(yú):白鰱() (27.0±2.0)g和羅非魚(yú)() (15.2±2.6)g分別購(gòu)自武漢關(guān)橋魚(yú)種基地和赤壁魚(yú)種養(yǎng)殖基地.實(shí)驗(yàn)前魚(yú)種先在室內(nèi)水池(1m×1m×0.4m)內(nèi)暫養(yǎng)7d,使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境.

1.2 亞急性毒性實(shí)驗(yàn)

亞急性毒性實(shí)驗(yàn)分組參照文獻(xiàn)[26-27],分成2組.2個(gè)為處理組,分別投放30條白鰱和30條羅非魚(yú),每天定時(shí)投喂經(jīng)過(guò)上述處理后的微囊藻藻漿,投喂的微囊藻生物量參照文獻(xiàn)方法[28],控制為0.5g干重藻/L.顯微鏡計(jì)數(shù)表明該投喂量相當(dāng)于水中微囊藻細(xì)胞密度為6×109cells/L.2個(gè)為對(duì)照組,分別投放30條白鰱和30條羅非魚(yú),用商業(yè)魚(yú)飼料喂食.所有水族箱中的水均用增氧泵并每天定時(shí)用曝氣脫氯后的水更換,使用增氧泵一是為了保持水中的溶解氧,二是使水體中微囊藻細(xì)胞充分混合并被魚(yú)類(lèi)所攝食.水溫用加熱棒維持在(23±2)℃.分別在實(shí)驗(yàn)前后測(cè)量魚(yú)體重、肝臟重量,實(shí)驗(yàn)持續(xù)28d.

1.2.1 對(duì)微囊藻及毒素?cái)z食、消化和降解情況的觀測(cè) 兩種魚(yú)對(duì)毒藻和微囊藻毒素的日攝入量:每7d對(duì)處理組水族箱中的水和投喂前的微囊藻取樣.魚(yú)對(duì)微囊藻的日攝入量()的計(jì)算公式為:

＝0.5g/L×200L×藻細(xì)胞密度日變化(%)/

水族箱內(nèi)魚(yú)重(kg) (1)

藻細(xì)胞密度日變化測(cè)定方法:水樣取樣2次,第1次取樣在投喂微囊藻后;第2次在第2d換水喂藻前進(jìn)行.藻細(xì)胞密度日變化根據(jù)2次取樣的藻細(xì)胞密度計(jì)算.魚(yú)對(duì)微囊藻毒素的日攝入量根據(jù)魚(yú)對(duì)微囊藻的日攝入量和微囊藻中的毒素含量計(jì)算.

顯微鏡觀察:收集白鰱和羅非魚(yú)糞便和投喂前微囊藻,Nikon E600型顯微鏡下觀察(′200,′400)并拍照.

白鰱和羅非魚(yú)糞便、投喂前微囊藻胞內(nèi)毒素含量測(cè)定:每7d對(duì)白鰱和羅非魚(yú)糞便和投喂前的微囊藻取樣,真空干燥器(Yamato, NEOCOOL)干燥后,參照文獻(xiàn)方法[24-25]提取測(cè)定微囊藻毒素含量.

1.2.2 魚(yú)類(lèi)組織器官中毒素含量測(cè)定 喂藻實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取處理組白鰱、羅非魚(yú)各15條,取肝臟組織,用0.85％生理鹽水漂洗,除去血液等雜物,濾紙拭干水分,分析天平上稱(chēng)重,真空干燥器(Yamato, NEOCOOL)干燥脫水.用解剖刀取魚(yú)約1g肌肉,剔除魚(yú)刺,蒸餾水清洗后用濾紙吸干水分,分析天平上稱(chēng)重,用手術(shù)剪將魚(yú)肉剪碎,真空干燥器干燥脫水.

魚(yú)肌肉和肝臟組織的毒素提取:采用純甲醇提取方法[29-30],取3批魚(yú)作為平行樣.每批取5條魚(yú)肝臟組織樣品、肌肉樣品分別混合, 放入瓷研缽中,加入液氮,將樣品冰凍并研磨成粉末狀,加入100%色譜純甲醇20~30mL,磁力攪拌器上攪拌提取,1h后,10000r/min離心,沉淀再加甲醇提取2次,離心合并上清液.用等體積正已烷萃取上清液2次,棄去正已烷層.上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮干燥后,加入20mL去離子水充分振蕩,過(guò)預(yù)先已活化的Sep-pak C18固相萃取柱(10mL 100%甲醇活化,10mL 去離子水調(diào)整).20mL 20%甲醇淋洗小柱后,用20~30mL 100% 純甲醇洗脫.洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮干燥,加入10mL去離子水,充分振蕩,用ELISA試劑盒(Envirologix microcystin plate kit, Portland, ME)測(cè)定毒素濃度,根據(jù)所提取樣品重量計(jì)算出微囊藻毒素在肌肉和肝臟中含量.

1.2.3 病理學(xué)檢測(cè) 肝系數(shù)(HSI)測(cè)定:分別在實(shí)驗(yàn)前后取處理組的白鰱、羅非魚(yú)各5條,測(cè)定魚(yú)體重、肝臟重量,根據(jù)Al-Ghais方法計(jì)算肝系數(shù)[31].計(jì)算公式:

HSI＝肝重量(g)/魚(yú)體重(g)′100% (2)

魚(yú)肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察:喂藻實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分別取處理組、對(duì)照組白鰱、羅非魚(yú)肝臟組織,切成1mm3小塊,先后用2.5%戊二醛溶液和1%OsO4固定,酒精梯度脫水后環(huán)氧樹(shù)脂包埋,LKB型超薄切片機(jī)切片,乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色[32].日立H-600型透射電鏡下觀察.

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 半致死劑量(LD50)測(cè)定 純化后的MC-LR用無(wú)菌0.85%生理鹽水溶解并稀釋成不同濃度,腹腔注射入白鰱和羅非魚(yú)體內(nèi),注射部位為魚(yú)的腹鰭下端.每個(gè)不同濃度下分別采用5條魚(yú),記錄魚(yú)死亡率,根據(jù)死亡率－劑量關(guān)系計(jì)算出半致死劑量LD50[33].

1.3.2 魚(yú)類(lèi)組織器官中GSH及相關(guān)酶測(cè)定 腹腔注射MC-LR:純化后的MC-LR用無(wú)菌0.85%生理鹽水溶解稀釋后,腹腔注射入白鰱和羅非魚(yú)體內(nèi)(各20條).注射劑量均為100μg/kg.分別在注射MC-LR后0,6,12,24,48,72h取樣,每次各取5條白鰱和羅非魚(yú).對(duì)照組也按上述方法設(shè)置:取等體積0.85%無(wú)菌生理鹽水腹腔注射白鰱和羅非魚(yú)(各20條),分別在注射MC-LR后0,6,12,24,48,72h取樣,每次各取3條白鰱和羅非魚(yú).取出魚(yú)肝臟制備10%肝組織勻漿液,測(cè)定GSH、GST和GSH-Px活性.

GSH及相關(guān)抗氧化酶活性測(cè)定:取1g左右上述魚(yú)肝臟組織塊除去雜質(zhì),拭干稱(chēng)重.加9倍預(yù)冷的0.86%生理鹽水,冰水浴下剪碎勻漿.4℃下3000r/min離心15min,取上清液,即得到10%肝臟組織勻漿[34]. GSH、GSH-ST、GSH-Px活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[34-35],分別采用商業(yè)試劑盒(GSH assay kit, A006-4; GSH- ST assay kit, A004; GSH-PX assay kit, A005; 南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定.在分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech,Ultrospec 3000) 412nm處測(cè)定光吸收值.

1.3.3 病理學(xué)檢測(cè) 取注射100μg/kg MC-LR后48h的兩種魚(yú)肝臟組織制備電鏡切片.為觀察外源性GSH對(duì)MC-LR的解毒作用,另取3條白鰱,預(yù)先注射劑量為1mg/kg 的GSH,2h后再腹腔注射(i.p.) 100μg/kg MC-LR.注射毒素48h后取魚(yú)肝臟組織制備電鏡切片,透射電鏡下觀察.

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS V19.0,用One-Way ANOVA法進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析,繪圖在OriginPro 2018軟件中進(jìn)行.數(shù)據(jù)表示方式為均值±標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果

2.1 微囊藻及毒素對(duì)白鰱和羅非魚(yú)的亞急性毒性效應(yīng)

在28d喂藻實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有魚(yú)死亡,表明白鰱、羅非魚(yú)在以產(chǎn)毒微囊藻為單一食物條件下均能存活, 2種魚(yú)都對(duì)微囊藻毒素表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性.

2.1.1 魚(yú)類(lèi)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻和微囊藻毒素?cái)z食、消化和降解 魚(yú)類(lèi)對(duì)毒藻和微囊藻毒素的日攝入量:白鰱、羅非魚(yú)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻的日攝入量依次為(6.02± 1.59),(7.94±2.73) g干重藻/kg. 2種魚(yú)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻和微囊藻毒素的日攝入量大致相同,羅非魚(yú)攝食能力略高于白鰱(圖1).白鰱、羅非魚(yú)對(duì)微囊藻毒素MC-RR的日攝入量依次為(7.34±1.95),(9.69± 3.34)mg/kg;對(duì)微囊藻毒素MC-LR日攝入量依次為(1.81±0.48)、(2.38±0.82)mg/kg.2種魚(yú)對(duì)微囊藻毒素的總攝入量(MC-RR＋MC-LR)達(dá)到10mg/kg左右.由于采集的銅綠微囊藻所含的毒素中 MC-RR占大部分比例,且MC-RR的毒性較低,約為MC-LR的1/10[19],這也可能是白鰱、羅非魚(yú)在該條件下能夠生存的原因之一.

白鰱對(duì)毒藻、MC日攝入量數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[28]

2種魚(yú)對(duì)微囊藻的消化能力:白鰱糞便中基本以完整群體形態(tài)的微囊藻為主,糞便絲狀,顏色翠綠色,表明白鰱對(duì)微囊藻消化能力差;羅非魚(yú)糞便中未觀察到群體形態(tài)微囊藻,呈咖啡色,表明藻類(lèi)色素被完全分解,羅非魚(yú)對(duì)微囊藻具較強(qiáng)消化能力.顯微鑒定進(jìn)一步表明,白鰱糞便中微囊藻占大部分比例(圖2B),且微囊藻群體形態(tài)相對(duì)于喂食前微囊藻(圖2A)無(wú)明顯變化;而在羅非魚(yú)糞便中觀察不到有完整藻細(xì)胞存在,微囊藻基本上被消化吸收(圖2C).顯微鑒定表明,白鰱對(duì)攝入的微囊藻消化能力差,而羅非魚(yú)對(duì)微囊藻的消化吸收能力遠(yuǎn)比白鰱強(qiáng).這與2種魚(yú)消化道內(nèi)消化酶對(duì)微囊藻毒素的降解能力差異一致.

圖2 投喂前微囊藻和白鰱及羅非魚(yú)糞便的顯微觀察

A.銅綠微囊藻水華, ×200; B.白鰱糞便, ×200; C.羅非魚(yú)糞便, ×400

魚(yú)類(lèi)對(duì)攝入的微囊藻毒素的降解:采集的銅綠微囊藻主要含MC-RR和MC-LR,毒素以MC-RR為主(圖3).微囊藻毒素被2種魚(yú)攝入后,由于魚(yú)體內(nèi)消化酶等作用,相對(duì)于喂食前的微囊藻,白鰱、羅非魚(yú)糞便中MC總含量分別下降到71.5%、6.0%,羅非魚(yú)消化降解MC的能力遠(yuǎn)高于白鰱(圖4).該數(shù)據(jù)一定程度上解釋了羅非魚(yú)對(duì)毒藻具較強(qiáng)耐受性.此外對(duì)比魚(yú)糞便和喂食前的毒藻,MC-RR與MC-LR比值的變化顯著,依次為3.66:1(喂食前微囊藻)、2.77:1(白鰱糞便)和1.97:1(羅非魚(yú)糞便).該數(shù)據(jù)表明:微囊藻毒素在被白鰱、羅非魚(yú)攝入,到經(jīng)糞便排出的過(guò)程中,部分毒素被魚(yú)消化道內(nèi)的消化酶降解.由于MC-RR、MC-LR的穩(wěn)定性存在差異,導(dǎo)致魚(yú)糞便中MC-RR和MC-LR的比值發(fā)生改變.羅非魚(yú)糞便中,MC含量急劇下降,且MC-RR和MC-LR比值變動(dòng)更為顯著,表明了羅非魚(yú)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞及毒素具有很強(qiáng)的裂解、消化能力.

圖3 產(chǎn)毒微囊藻及2種魚(yú)糞便中毒素分析HPLC圖譜

Fig.3 The HPLC chromatogram of microcystins in Microcystis, sliver carp feces and tilapia feces

白鰱糞便MC含量數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[28]

2.1.2 微囊藻毒素在魚(yú)肌肉和肝臟中的累積 喂食產(chǎn)毒微囊藻28d后,微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉中積累量依次為(1.57±0.31)μg/kg、(10.81±6.52) μg/kg(鮮重);在白鰱、羅非魚(yú)肝臟中積累量依次為(4.28±1.64)mg/kg、(2.48±0.15)mg/kg (鮮重).微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉、肝臟中的積累量均存在顯著差異性(<0.05).羅非魚(yú)肌肉中毒素含量是白鰱的6.9倍;而肝臟中毒素含量上,羅非魚(yú)是白鰱的58%,顯著低于白鰱(圖5).

圖5 微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉和肝臟中的積累

其中白鰱體內(nèi)MC積累數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[28],*<0.05

總體分析,微囊藻毒素在2種魚(yú)體內(nèi)積累量均很低,在魚(yú)肉和肝臟中積累量?jī)H為′10-9和′10-6級(jí).相對(duì)于攝入的微囊藻毒素量[10mg/(kg·d)],微囊藻毒素在2種魚(yú)體內(nèi)積累量微乎其微.

2.1.3 病理學(xué)反應(yīng) 肝系數(shù)變化:通過(guò)28d喂藻實(shí)驗(yàn),白鰱肝臟重量顯著下降(<0.01),羅非魚(yú)肝臟重量變化不明顯;白鰱和羅非魚(yú)的肝系數(shù)(HIS)均表現(xiàn)出顯著差異性下降(<0.05)(圖6).喂食毒藻實(shí)驗(yàn)中,白鰱肝臟重量、兩種魚(yú)的肝系數(shù)均顯著下降的原因,可能是兩種魚(yú)在逆境條件下能量攝取不足,肝臟中糖元等儲(chǔ)能物質(zhì)被大量消耗利用導(dǎo)致(見(jiàn)圖7電鏡照片,2種魚(yú)肝細(xì)胞糖元消耗明顯).

魚(yú)肝臟超微結(jié)構(gòu)變化:對(duì)照組正常白鰱肝細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊、線粒體結(jié)構(gòu)正常、富含糖原顆粒且基本無(wú)脂肪滴(圖7A,B);正常羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)線粒體正常、有少量脂滴、富含大量雪花狀糖原顆粒、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊、核結(jié)構(gòu)正常(圖7C,D);喂食產(chǎn)毒微囊藻28d后,白鰱肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量巨大的脂滴,線粒體嵴較清晰,但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體均有腫大的現(xiàn)象(圖7E,F,G);喂食產(chǎn)毒微囊藻28d后的羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)同樣有大量脂滴出現(xiàn),但線粒體嵴清晰可見(jiàn),細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變(圖7H,I,J).脂滴病變較明顯.2種魚(yú)在喂食產(chǎn)毒微囊藻28d后,肝組織細(xì)胞均表現(xiàn)出較明顯脂滴病變,白鰱肝細(xì)胞病變程度高于羅非魚(yú).

*<0.05,**<0.01

A.正常白鰱肝細(xì)胞,×8000;B.正常白鰱肝細(xì)胞,×15000;C.正常羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×8000;D.正常羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×17000;E.喂食毒藻28d后白鰱肝細(xì)胞,×6000;F.喂食毒藻28d后白鰱肝細(xì)胞,×12000;G.喂食毒藻28d后白鰱肝細(xì)胞,×12000;H.喂食毒藻28d后羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×8000;I.喂食毒藻28d后羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×8000;J.喂食毒藻28d后羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×30000

2.2 微囊藻毒素對(duì)白鰱和羅非魚(yú)的性毒性效應(yīng)

2.2.1 半致死劑量(LD50)比較 依據(jù)表1做出致死率-對(duì)數(shù)劑量曲線,求出MC-LR對(duì)白鰱和羅非的LD50.計(jì)算結(jié)果得出MC-LR對(duì)白鰱、羅非魚(yú)的LD50依次為270,790μg/kg.而MC-LR對(duì)小鼠的LD50為50μg/kg[19],因此在對(duì)MC的耐受性上,羅非魚(yú)>白鰱>小鼠,羅非魚(yú)對(duì)毒素耐受性比白鰱更強(qiáng).

表1 i.p.注射不同劑量MC-LR對(duì)白鰱和羅非的致死率

Table 1 Mortality of sliver carp and tilapia after injected with different doses of MC-LR

2.2.2 GSH含量、GST、GSH-Px活性變化 與對(duì)照組相比,白鰱注射100μg/kg MC-LR 6h后,肝臟組織中GSH急劇下降至74%,與對(duì)照差異顯著(< 0.05).此后GSH含量緩慢恢復(fù),在72h后恢復(fù)到MC-LR注射前水平(圖8).羅非魚(yú)注射100μg/kg MC-LR后,其肝臟組織中GSH含量同樣在短時(shí)間內(nèi)顯著下降,在6~12h期間GSH含量迅速恢復(fù)并上升至較高濃度, 與對(duì)照差異顯著(<0.05),12h后GSH含量高達(dá)MC-LR注射前的1.4倍.該結(jié)果顯示出羅非魚(yú)在毒素急性暴露后,肝臟組織內(nèi)GSH快速參與了對(duì)MC的解毒作用,并表現(xiàn)出極強(qiáng)的GSH補(bǔ)償性再生合成能力.

圖8 i.p.注射100μg/kg MC-LR后白鰱、羅非魚(yú)肝臟組織GSH含量的變化

*<0.05

對(duì)比100μg/kg MC-LR后兩種魚(yú)肝組織內(nèi)GSH含量變化結(jié)果(圖8),兩種魚(yú)在MC-LR注射后,GSH含量均在6h內(nèi)明顯下降,表明GSH在注射MC-LR 6h內(nèi)被大量消耗.6h后兩種魚(yú)GSH含量均逐步回升,其中羅非魚(yú)肝臟GSH含量在6,12,24,72h分別是白鰱的78%、128%、127%和107%,二者差異顯著(<0.05).羅非魚(yú)顯示出更強(qiáng)的GSH再生能力和解毒潛力.

GSH-Px、GST都能以GSH為底物,清除機(jī)體的過(guò)氧化氫和有機(jī)氫過(guò)氧化物,在消除微囊藻毒素進(jìn)入機(jī)體后帶來(lái)的氧化脅迫中起到重要作用.對(duì)比兩種魚(yú)注射MC-LR前后肝臟組織GST活性(圖9),羅非魚(yú)肝臟組織GST在MC-LR注射前后無(wú)明顯變化,而白鰱GST活性在MC-LR注射6h后顯著下降至注射前的47%,并在隨后6~72h期間持續(xù)維持在較低水平.

*<0.05

在MC-LR注射后,羅非魚(yú)肝臟組織GSH-Px活性持續(xù)上升,72h后上升至注射前184%.而白鰱GSH-Px活性在MC-LR注射后6h下降明顯,為注射前的72%;隨后活性略有恢復(fù),但72h仍無(wú)法恢復(fù)至注射前水平.

對(duì)比2種魚(yú)的GST、GSH-Px活性,羅非魚(yú)肝臟GST活性遠(yuǎn)顯著高于白鰱(<0.05),且GSH-Px活性在毒素暴露后得到激活并持續(xù)上升.該結(jié)果也表明了羅非魚(yú)體內(nèi)GSH相關(guān)酶活性在毒素暴露下能迅速激活,從而為解毒提供了有利環(huán)境.

圖10 急性毒性實(shí)驗(yàn)白鰱羅非魚(yú)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變

A.注射MC-LR 48h白鰱肝細(xì)胞,×20000;B.注射MC-LR 48h白鰱肝細(xì)胞,×15000; C.注射MC-LR 48h白鰱肝細(xì)胞,×5000;D.注射MC-LR 48h羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×5000;E.注射MC-LR 48h羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×10000; F.注射MC-LR 48h羅非魚(yú)肝細(xì)胞,×20000; G.預(yù)先注射1mg/kg GSH 2h后再注射MC-LR,48h白鰱肝細(xì)胞,×20000;H.預(yù)先注射1mg/kg GSH 2h后再注射MC-LR,48h白鰱肝細(xì)胞,×10000

2.2.3 魚(yú)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化情況 注射100μg/ kg MC-LR 48h后的白鰱肝細(xì)胞發(fā)生了明顯病變.表現(xiàn)為:糖原顆粒減少,脂滴大量出現(xiàn)(圖10A,B);線粒體腫大,部分發(fā)生髓鞘樣結(jié)構(gòu)病變(圖10A,B的箭頭處);大量出現(xiàn)死亡的肝細(xì)胞(圖10C).注射100μg/kg MC-LR 48h后的羅非魚(yú)肝細(xì)胞病變同注射毒素后的白鰱相似,表現(xiàn)為:數(shù)目眾多巨大脂肪滴出現(xiàn),糖原顆粒很少(圖10D,E);部分核膜消失(圖10F);線粒體腫大,基質(zhì)密度降低(圖10E),有髓鞘樣結(jié)構(gòu)病變發(fā)生(圖10F箭頭處).預(yù)先注射1mg/kg GSH 2h后再注射100μg/kg MC-LR,48h后白鰱肝細(xì)胞表現(xiàn)為:細(xì)胞內(nèi)基本無(wú)脂滴出現(xiàn)、糖原顆粒較豐富、部分線粒體腫大.和直接注射100μg/kg MC-LR 48h后的白鰱肝細(xì)胞相比,死亡細(xì)胞數(shù)明顯下降(圖10G,H).

急性毒性暴露實(shí)驗(yàn)中,白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)再次出現(xiàn)大量脂滴,而預(yù)先注射1mg/kg GSH的肝細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象發(fā)生.急性暴露實(shí)驗(yàn)中肝細(xì)胞脂滴大量出現(xiàn)的現(xiàn)象與亞急性暴露實(shí)驗(yàn)中2種魚(yú)肝細(xì)胞病變情況相同.

3 討論

3.1 微囊藻毒素對(duì)白鰱和羅非魚(yú)的急性、亞急性毒性效應(yīng)

在28d喂食毒藻的亞急性實(shí)驗(yàn)中,羅非魚(yú)肌肉中毒素含量是白鰱的6.9倍;而肝臟中毒素含量羅非魚(yú)是白鰱的58%,顯著低于白鰱.可能由于羅非魚(yú)體內(nèi)消化酶活性較高,導(dǎo)致攝入的微囊藻細(xì)胞大量裂解,從而釋放出較多的微囊藻毒素進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致.羅非魚(yú)肝臟中毒素積累量相對(duì)較低,表明羅非魚(yú)肝臟對(duì)微囊藻毒素的降解功能強(qiáng)于白鰱.

對(duì)比兩種不同毒素暴露方式下,MC對(duì)2種魚(yú)的毒性效應(yīng)、結(jié)合2種魚(yú)肝臟超微結(jié)構(gòu)病變的結(jié)果,注射MC-LR方式的急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞的損傷遠(yuǎn)大于喂食產(chǎn)毒微囊藻的方式.在同等毒素暴露的條件下,肝臟細(xì)胞的羅非魚(yú)肝細(xì)胞受損程度略小于白鰱,揭示了羅非魚(yú)比白鰱對(duì)微囊藻毒素具更強(qiáng)的抗性,與2種魚(yú)肝臟中毒素積累量的測(cè)定結(jié)果一致.

羅非魚(yú)對(duì)外源微囊藻毒素比白鰱有更強(qiáng)的解毒能力.在魚(yú)體內(nèi),GSH可防御MC帶來(lái)的氧化性損傷,并與MC相結(jié)合形成GSH-MC結(jié)合物是解毒的第一步[36].因此,兩種控藻魚(yú)體內(nèi)GSH水平的應(yīng)激性修復(fù)能力、GSH相關(guān)酶系統(tǒng)的活性恢復(fù)能力是表征兩種魚(yú)解毒能力的重要標(biāo)志.本研究證明了兩種魚(yú)對(duì)MC-LR的解毒作用與GSH及其合成代謝相關(guān)的酶系統(tǒng)相關(guān)聯(lián).羅非魚(yú)在外源毒物進(jìn)入后,體內(nèi)的GSH能在較短時(shí)間內(nèi)迅速上升并維持在較高水平.電鏡觀察結(jié)果表明外源性GSH對(duì)白鰱肝臟細(xì)胞也起到了很好保護(hù)作用,證明了GSH在2種控藻魚(yú)類(lèi)解毒過(guò)程中的重要作用.

3.2 微囊藻毒素暴露下2種魚(yú)肝細(xì)胞脂滴病變

綜合兩種MC暴露途徑,均導(dǎo)致了白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴大量出現(xiàn),而兩種魚(yú)的對(duì)照組、預(yù)先注射GSH保護(hù)后再注射MC-LR的白鰱肝細(xì)胞內(nèi)脂滴大小和數(shù)量基本正常.這種MC暴露下白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴大量出現(xiàn)的現(xiàn)象尚少有文獻(xiàn)報(bào)道.肝細(xì)胞脂滴病變是一種可逆性病變,魚(yú)類(lèi)暴露在銅、鎘等重金屬污染條件下,肝細(xì)胞內(nèi)有形成大量脂肪滴的類(lèi)似報(bào)道[37-38].結(jié)合GSH及相關(guān)酶的實(shí)驗(yàn)推測(cè),該脂滴病變現(xiàn)象表明微囊藻毒素可能參與了干擾魚(yú)肝臟細(xì)胞的脂肪代謝途徑.其原因有待進(jìn)一步研究.

3.3 白鰱和羅非魚(yú)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻和微囊藻毒素的適應(yīng)機(jī)制

本實(shí)驗(yàn)中喂食微囊藻的細(xì)胞密度達(dá)到6× 109cell/L,超過(guò)絕大多數(shù)有微囊藻水華爆發(fā)的天然水體的藻細(xì)胞密度.白鰱和羅非魚(yú)均對(duì)產(chǎn)毒微囊藻和微囊藻毒素有較強(qiáng)的抗性.其中羅非魚(yú)抗性又略高于白鰱.

白鰱對(duì)產(chǎn)毒微囊藻的適應(yīng)機(jī)制:在喂食產(chǎn)毒微囊藻的實(shí)驗(yàn)中,白鰱攝入的微囊藻毒素大部分經(jīng)糞便直接被排出體外.由于白鰱無(wú)真正的胃[39],該濾食性魚(yú)類(lèi)對(duì)攝入微囊藻營(yíng)養(yǎng)的獲取主要取自微囊藻的群體膠鞘和附著的細(xì)菌,而非微囊藻細(xì)胞本身[40],且微囊藻毒素是胞內(nèi)毒素,只有當(dāng)藻細(xì)胞死亡裂解后才能釋放出來(lái)[41-42],因此白鰱攝食產(chǎn)毒微囊藻后,微囊藻毒素能較完整地保存在藻細(xì)胞內(nèi),從而大大減輕了對(duì)其危害.另一方面,白鰱肝細(xì)胞中GSH也具有良好的補(bǔ)償性再生能力,保證了對(duì)毒素具一定的抗性.白鰱的這種攝食機(jī)制保證了它能以產(chǎn)毒微囊藻為食而受到較輕的危害.

羅非魚(yú)對(duì)產(chǎn)毒微囊藻的適應(yīng)機(jī)制:羅非魚(yú)胃中消化液呈強(qiáng)酸性,pH值最低僅為1.4[43],這種強(qiáng)酸環(huán)境可有效地裂解藍(lán)藻細(xì)胞,同時(shí)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞具很強(qiáng)的裂解、消化和利用能力[43-44],也保證了對(duì)微囊藻毒素有較強(qiáng)的降解能力.另一方面,相對(duì)于白鰱,羅非魚(yú)體內(nèi)GSH含量在外源性毒素進(jìn)入體內(nèi)后能迅速地應(yīng)激性上升,同時(shí)GSH相關(guān)酶活性維持在較高水平,保證了羅非魚(yú)對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的微囊藻毒素具較高的清除效率.在上述綜合作用下,保證了羅非魚(yú)對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的微囊藻毒素有更強(qiáng)耐受能力.

3.4 白鰱和羅非魚(yú)用于控制藍(lán)藻水華風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目前有多種魚(yú)類(lèi)如白鰱、鳙魚(yú)和羅非魚(yú)被用于控制水體中藍(lán)藻水華.由于微囊藻毒素能在魚(yú)體內(nèi)積累從而對(duì)人類(lèi)健康帶來(lái)潛在的危害,WHO推薦人體每日可允許攝入的微囊藻毒素量TDI不大于0.04μg/kg人體重[19].根據(jù)WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn),按成人平均體重60kg計(jì)算,則每人每天可攝入的微囊藻毒素量不超過(guò)2.4μg.假設(shè)人均每天吃魚(yú)300g,則魚(yú)肉中微囊藻毒素含量不能超過(guò)8.0μg/kg魚(yú)濕重.

根據(jù)喂藻28d的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉中的積累量分別為(1.57±0.31),(10.8± 2.1)μg/kg魚(yú)濕重.從食用安全性角度評(píng)價(jià),毒素在羅非魚(yú)肌肉中積累量超過(guò)8.0μg/kg魚(yú)重的標(biāo)準(zhǔn),藍(lán)藻水華爆發(fā)水體中的羅非魚(yú)不適于食用,而白鰱肌肉中微囊藻毒素積累量則在WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi).

其他文獻(xiàn)也支持了本文的研究.長(zhǎng)期暴露在產(chǎn)毒藍(lán)藻水華的情況下,微囊藻在羅非魚(yú)肌肉中的積累量為0~337.3μg/kg 魚(yú)重[30],遠(yuǎn)超WHO推薦范圍;通過(guò)對(duì)北美10多個(gè)湖泊中魚(yú)體微囊藻毒素含量的監(jiān)測(cè)表明,在所有存在羅非魚(yú)的5個(gè)湖泊中,羅非魚(yú)體內(nèi)微囊藻毒素含量依次為2.7~6.2,2.0,2.1~19.3, 7.1~33.8,3.4~14.1μg/kg魚(yú)濕重[45],半數(shù)湖泊中羅非魚(yú)體內(nèi)毒素?cái)?shù)據(jù)均超過(guò)了WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn).而在水華嚴(yán)重爆發(fā)的太湖中,白鰱體內(nèi)MC含量最高為0.094μg/kg魚(yú)干重(以常規(guī)魚(yú)的肌肉含水量80%計(jì),相當(dāng)于MC最高含量0.024μg/kg魚(yú)濕重)[46].Zhang等[47]對(duì)國(guó)內(nèi)8個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊中白鰱體內(nèi)MC進(jìn)行了監(jiān)測(cè),白鰱肌肉中MC含量范圍為0.014~ 0.036μg/g DW(相當(dāng)于2.8~7.2μg/kg魚(yú)濕重,以魚(yú)的肌肉含水量80%計(jì)),均在WHO推薦的食用安全范圍之內(nèi).

由此可見(jiàn),從食用安全性角度出發(fā),與羅非魚(yú)相比,白鰱是更適合用于控制藍(lán)藻水華的魚(yú)種,可以廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻水華控制的實(shí)際操作中.

4 結(jié)論

4.1 在亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中,白鰱、羅非魚(yú)對(duì)MC日攝入量達(dá)10mg/kg,2種魚(yú)均對(duì)MC有較強(qiáng)抗性.微囊藻經(jīng)魚(yú)攝入后,MC含量在白鰱、羅非魚(yú)糞便中分別下降到71.5%、6.0%,羅非魚(yú)對(duì)MC降解能力遠(yuǎn)高于白鰱.白鰱和羅非魚(yú)肝系數(shù)分別從(1.19±0.21)%、(2.24±0.19)%下降到(0.79±0.06)%、(1.72±0.07)%,均顯著下降(<0.05).微囊藻毒素在白鰱、羅非魚(yú)肌肉中積累量分別為(1.57±0.31)μg/kg、(10.81±6.52)μg/ kg(鮮重)、肝臟中積累量分別為(4.28±1.64)mg/kg、(2.48±0.15)mg /kg (鮮重).MC在白鰱、羅非魚(yú)的肌肉、肝臟中積累量均存在顯著差異性(<0.05).

4.2 在急性毒性實(shí)驗(yàn)中,MC-LR對(duì)白鰱、羅非魚(yú)的LD50為270,790μg/kg,羅非魚(yú)對(duì)MC有更強(qiáng)耐受性.注射MC-LR后2種魚(yú)肝組織谷胱甘肽(GSH)含量和相關(guān)GST、GSH-Px酶均發(fā)生顯著變動(dòng).羅非魚(yú)GSH、GSH-Px酶恢復(fù)能力和GST酶活性水平顯著高于白鰱.

4.3 毒性實(shí)驗(yàn)中微囊藻毒素急性、亞急性暴露均導(dǎo)致白鰱和羅非魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴大量出現(xiàn),但白鰱、羅非魚(yú)對(duì)微囊藻及毒素具有不同生理適應(yīng)機(jī)制,白鰱主要攝食群體微囊藻的群體膠鞘和附著細(xì)菌,胞內(nèi)微囊藻毒素釋放量小,導(dǎo)致其能以毒藻為食而受危害較輕.而羅非魚(yú)體內(nèi)消化酶對(duì)微囊藻和MC具較強(qiáng)消化降解能力;且GSH含量及相關(guān)酶活性水平高,對(duì)體內(nèi)毒素清除效率高.

4.4 從食用安全性角度出發(fā),白鰱是更適合用于控制藍(lán)藻水華的魚(yú)種,可廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻水華控制中.

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The acute and subacute response of sliver carp and tilapia to microcystin.

SHEN Qiang1*, LIU Yong-ding2, LI Dun-hai2, LI Si-xin1

(1.Key Laboratory of Ecological Impacts of Hydraulic-Projects and Restoration of Aquatic Ecosystem of Ministry of Water Resources, Institute of Hydroecology, Ministry of Water Resources and Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430079, China；2.Institute of Hydrobiology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)., 2019,39(6)：2633~2643

In order to study adaptative mechanisms of sliver carp and tilapia on harmful algal blooms and provide scientific methods of fish species selection in biological manipulation, systematic research was conducted on bioaccumulation, degradation of microcystin and the differences in resistance and detoxification mechanisms on sliver carp () and tilapia (). In toxicfeeding experiment, the daily intake of microcystin by sliver carp and tilapia was up to 10mg/kg body weight. Both fishes show strong resistance to MC. Microcystin concentrations in feces of sliver carp and tilapia afterintake were significantly decreased to 71.5% and 6.0% respectively (<0.05). The degradation ability of tilapia to toxicand microcystin is much higher than silver carp. The hepatosomatic index of sliver carp and tilapia was significantly decreased from (1.19±0.21)% and (2.24±0.19)% to (0.79±0.06)% and (1.72±0.07)% respectively (<0.05). Bioaccumulations of MC of the two species were (1.57±0.31) and (10.81±6.52)μg/kg (fresh weight) in the muscle, (4.28±1.64) and (2.48±0.15)mg/kg (fresh weight) in the liver. There were significant differences between MC accumulation in the muscle and liver of each species (<0.05). Microcystin concentration in the muscle of tilapia was 6.9 times higher than that of silver carp. During the toxic experiment, LD50of microcystin-LR was 270μg/kg on sliver carp and 790μg/kg on tilapia, which suggested microcystin tolerance of tilapia is stronger than that of sliver carp. Enormous lipid droplets were observed in the liver cell of the two species whether fed withor intraperitoneally injected with microcystin. After intraperitoneal injection with microcystin-LR, the content of GSH in the two species showed a significant decrease in 6h and then increased gradually. Significant difference of GSH content was found between the two species (<0.05). The results showed that the degradation ability of tilapia to microcystin is much higher than silver carp. Silver carp mainly feeds on the mucilage sheath and adhesion bacteria of colonialwith small amount of intracellular microcystin released. This mechanism can effectively protect silver carp fed withto less damage. The digestive enzymes in tilapia have strong digestion and degradation ability toand microcystin, and the high level of GSH content and related enzyme activity ensure efficient detoxification of toxins. From the view of food safety, compared with tilapia, silver carp is the species which is more suitable and to be widely used for cyanobacteria bloom control.

harmful algal blooms (HABs)；microcystin；sliver carp；tilapia；resistance mechanism

X174

A

1000-6923(2019)06-2633-11

沈 強(qiáng)(1975-),男,河南潢川人,高級(jí)工程師,博士,主要研究方向?yàn)樵孱?lèi)學(xué)和水生態(tài)監(jiān)測(cè)新技術(shù)研究.發(fā)表論文20余篇.

2018-11-12

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2017CFB678);948計(jì)劃項(xiàng)目(201509)

*責(zé)任作者, 博士, shenqiang2005@gmail.com