王 輝,曾曉房,,馮衛(wèi)華,,于立梅,翟萬(wàn)京,白衛(wèi)東,,曾令鋼

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510550;2.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司,廣東河源 517000)

我國(guó)是檸檬種植大國(guó),2013年全國(guó)檸檬種植面積高達(dá)5萬(wàn)公頃,且檸檬平均每畝產(chǎn)量高達(dá)1066.7千克[1]。檸檬果肉可食用,但檸檬皮呈苦味,以提取檸檬精油、果膠、膳食纖維等加工為主。檸檬皮中含有豐富的檸檬苦素,檸檬苦素及其類似物是一類含有4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾體基本骨架結(jié)構(gòu)的化合物。目前已分離出36種檸檬苦素類似物和19種配糖體,包括檸檬苦素、諾米林、諾米林酸、奧巴叩酮等[2]。已發(fā)現(xiàn)檸檬苦素類化合物具有抑菌、殺蟲(chóng)、消炎、抗腫瘤等作用[3-4]。根霉(Rhizopus)是廣泛存在于自然界中的一類真菌,是釀造業(yè)常用的糖化菌,但也會(huì)引起食物等霉變[5]。已有利用羅漢果、木醋液、植物黃酮、黃芩提取物等對(duì)根霉的抑菌性能的研究[5-8]。也有關(guān)于檸檬苦素抑菌活性的研究,如李彪等[9]發(fā)現(xiàn)柚子皮中檸檬苦素對(duì)小麥紋枯病原菌、水稻紋枯病原菌等的生長(zhǎng)有一定抑制作用;李赤翎等[10]發(fā)現(xiàn)檸檬苦素類似物對(duì)細(xì)菌與真菌的抑制效果明顯。但尚未有檸檬苦素對(duì)根霉的抑菌活性和抑菌機(jī)理的研究。

因此,本文以根霉為研究對(duì)象,通過(guò)測(cè)定檸檬苦素對(duì)根霉的MIC、MBC、孢子萌發(fā)抑制率和菌絲生長(zhǎng)抑制率確定抑菌活性,并進(jìn)一步研究了多種因素對(duì)抑菌活性的影響。同時(shí),通過(guò)測(cè)定根霉胞外蛋白質(zhì)含量、堿性磷酸酶(AKP)活力、菌絲體總糖含量,并結(jié)合掃描電鏡觀察,初步闡述檸檬苦素對(duì)根霉的抑菌機(jī)理,為開(kāi)發(fā)檸檬苦素作為天然抑菌劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂檸檬皮粉 廣東中興綠豐發(fā)展有限公司提供;根霉(Rhizopus) 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.98%) 濟(jì)寧天之藍(lán)生物科技有限公司;堿性磷酸酶試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)-G250、蒽酮 北京索萊寶科技有限公司;福林試劑、石油醚、二氯甲烷、無(wú)水乙醇等 均為分析純。

JEOL-6360LV型掃描電子顯微鏡、JFD-320型冷凍干燥儀、JFC-1600型離子濺射儀 日本電子株式會(huì)社;DDS-18A型精密數(shù)字式電導(dǎo)率儀 上海日島科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PYX-280S-A型生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV759型紫外分光光度計(jì) 上海橫搖科技有限公司;DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;THZ-82型冷凍水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠;XHRE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州豫華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬皮中檸檬苦素溶液的制備 10 g脫脂檸檬皮粉中加入400 mL 80%乙醇溶液,60 ℃下振蕩提取120 min后真空濃縮至10 mL。濃縮液加入等體積的二氯甲烷重復(fù)萃取5次后,40 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到檸檬苦素結(jié)晶。使用時(shí)以適量15%乙醇溶液溶解制得檸檬苦素溶液[11]。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 向根霉的PDA斜面培養(yǎng)物中加入無(wú)菌生理鹽水,將孢子洗脫,后用400目滅菌紗布過(guò)濾制得孢子懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮液濃度為108個(gè)/mL,4 ℃冰箱保藏,備用。

1.2.3 檸檬苦素抑制根霉活性的測(cè)定

1.2.3.1 MIC及MBC的測(cè)定 用試管法測(cè)定MIC。用移液槍移取2 mL質(zhì)量濃度為10000 μg/mL檸檬苦素溶液于1號(hào)試管中;接著從第1管中移取1 mL液體于2號(hào)管中;按照此倍半稀釋法稀釋至8號(hào)管。1～8號(hào)試管分別加入0.9 mL PDB培養(yǎng)基和0.1 mL根霉孢子懸浮液。9號(hào)試管為空白對(duì)照,只加入培養(yǎng)基和檸檬苦素溶液,不接種菌液;10號(hào)管為菌液對(duì)照組,不加入檸檬苦素溶液,均以無(wú)菌水代替。28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d[12]。以試管中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度檸檬苦素濃度為MIC。分別從無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中各取100 μL液體涂布于PDA平板培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d,以培養(yǎng)皿中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低檸檬苦素濃度為MBC。

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(對(duì)照組萌發(fā)數(shù)-處理組萌發(fā)率)×100/對(duì)照組萌發(fā)數(shù)

1.2.3.3 菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 在培養(yǎng)皿中分別加入不同質(zhì)量濃度(如1.2.3.2)的檸檬苦素溶液和PDA培養(yǎng)基,充分混勻,使每個(gè)平板培養(yǎng)基中檸檬苦素溶液的最終濃度分別為1250、625、312.5、156.25、78.125 μg/mL,備用。從用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的根霉菌落邊緣取直徑為4 mm的菌餅,將菌餅分別接種于平板培養(yǎng)基正中央,每個(gè)平板接種一個(gè)菌餅,菌絲面朝下,28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。每組重復(fù)3次。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。以不同檸檬苦素濃度的對(duì)數(shù)值和菌絲生長(zhǎng)抑制率,計(jì)算檸檬苦素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的毒力方程和半最大效應(yīng)濃度EC50[14]。以15%無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照。

菌落直徑(mm)=測(cè)量菌落平均值-打孔器直徑

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)×100/對(duì)照組菌落直徑

1.2.4 不同因素對(duì)檸檬苦素抑制根霉活性的影響

1.2.4.1 抑菌圈測(cè)定方法 在每個(gè)含根霉孢子濃度為106個(gè)/mL的PDA平板培養(yǎng)基上用打孔器打出3個(gè)直徑6 mm的小孔,分別加入85 μL檸檬苦素樣液、15%乙醇、無(wú)菌水,28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每組重復(fù)3次。用十字交叉法測(cè)量其抑菌圈直徑。

1.2.4.2 不同溫度對(duì)檸檬苦素溶液抑制根霉活性的影響 將檸檬苦素溶液置于40、60、80、100 ℃恒溫加熱30 min,若加熱后出現(xiàn)體積損失,則用15%乙醇調(diào)節(jié)至原體積,處理完畢后按照“1.2.4.1”測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4.3 不同pH檸檬苦素溶液的配制 配制不同pH的緩沖溶液,與檸檬苦素溶液以3∶1的比例混合,制成pH分別為2、4、6、8、10的檸檬苦素樣液后按照“1.2.4.1”測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4.4 明膠對(duì)檸檬苦素抑制根霉活性的影響 檸檬苦素溶液與1 mg/mL的明膠溶液以1∶1 (v/v)的比例混合均勻,置于室溫下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4.5 Fe3+和Fe2+對(duì)檸檬苦素抑制根霉活性的影響 檸檬苦素溶液分別與10 mmol/L的FeCl3、FeSO4溶液以9∶1 (v/v)的比例混合均勻,室溫下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.5 檸檬苦素抑制根霉的機(jī)理

1.2.5.1 檸檬苦素對(duì)根霉菌絲體總糖的影響 采用蒽酮比色法[15]。移取5 mL PDB培養(yǎng)液與0.1 mL根霉孢子懸浮液至離心管,28 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后,分別加入等量不同濃度(0、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mg)的檸檬苦素溶液。以加入等量的15%乙醇作為對(duì)照?；旌弦赫袷幣囵B(yǎng)3 d后過(guò)濾得根霉菌絲,用蒸餾水沖洗菌絲數(shù)遍后用濾紙吸干。稱取0.05 g菌絲,加入蒸餾水研磨至糊狀后加水至5 mL,沸水浴15 min后快速冷卻至室溫。用蒸餾水定容至25 mL,加入0.25 mL 10%醋酸鉛溶液,充分搖勻,以沉淀其中的蛋白質(zhì)。反應(yīng)完全后,加入0.05 g草酸以除去過(guò)量的醋酸鉛溶液,充分搖勻,反應(yīng)完全后過(guò)濾。分別取濾液2 mL,加入0.5 mL蒽酮試劑和5 mL濃H2SO4,搖勻后密封置于沸水浴加熱5 min后,快速冷卻至室溫,靜置片刻,于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。根據(jù)已得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.009x+0.0031,R2=0.9979)得到含糖量A。

式中:A為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的含糖量,μg;V為總體積,mL;Vs為測(cè)定取樣體積,mL;W為樣品質(zhì)量,g。

1.2.5.2 檸檬苦素對(duì)根霉胞外可溶性蛋白含量的影響 采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[16]。制得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0058x-0.0135,R2=0.9931。將根霉孢子懸液接種于PDB培養(yǎng)基,加入檸檬苦素使其最終濃度為MIC后,置于28 ℃恒溫培養(yǎng),分別于0、8、16、24、32、40 h移取孢子懸浮液,1000 r/min離心10 min后,取0.1 mL上清液、5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑和0.9 mL蒸餾水,充分混勻,放置5 min后,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。以加入15%乙醇為對(duì)照。根據(jù)所測(cè)樣液的OD值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.3 根霉菌液堿性磷酸酶(AKP)活力的測(cè)定 采用比色法[17]。調(diào)整濃度為106個(gè)/mL的根霉孢子懸浮液中的檸檬苦素最終濃度為1×MIC。將混合液于28 ℃,150 r/min振蕩孵育0、2、4、6、8、10 h后,1000 r/min離心10 min,取上清液按照堿性磷酸酶(AKP)試劑盒方法測(cè)定其AKP活力。以15%乙醇作為對(duì)照。

1.2.5.4 掃描電鏡分析 取100 μL 106個(gè)/mL的根霉孢子懸浮液涂布在PDA平板培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,用打孔器制得直徑為4 mm的菌餅,將菌餅倒置在含有2×MIC濃度檸檬苦素的PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48h。用無(wú)菌的鑷子將平板上的菌絲刮下,放入裝有2.5%戊二醛固定液的離心管內(nèi),在4 ℃下固定13 h。用pH為5.6的磷酸鹽緩沖液沖洗5 min,共洗2次,以去除孢子中的戊二醛。在4 ℃、12000 r/min條件下離心10 min,除去上清液,加入0.5 mL無(wú)菌水搖晃至孢子懸浮。取一滴于潔凈的蓋玻片上,經(jīng)空氣干燥后,噴金鏡檢[18]。以15%乙醇為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)測(cè)定均重復(fù)三次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)中的One-Way ANOVA對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素抑制根霉的活性

2.1.1 檸檬苦素對(duì)根霉的MIC和MBC 由表1可知,檸檬苦素對(duì)根霉的MIC為1250 μg/mL,MBC為5000 μg/mL。

表1 檸檬苦素對(duì)根霉的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of limonoids against Rhizopus

2.1.2 檸檬苦素對(duì)根霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)抑制率的影響 由表2可知,檸檬苦素抑制根霉孢子萌發(fā)的EC50值約為菌絲生長(zhǎng)的EC50值的53.79%。由圖1可知,檸檬苦素質(zhì)量濃度為312.5 μg/mL時(shí),對(duì)根霉孢子萌發(fā)的抑制率開(kāi)始快速提高;而對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率在濃度高于625 μg/mL時(shí)開(kāi)始快速提高。檸檬苦素質(zhì)量濃度為156.25～1250 μg/mL時(shí),孢子萌發(fā)抑制率的提升速率較快;在檸檬苦素質(zhì)量濃度為1250～2500 μg/mL時(shí),菌絲生長(zhǎng)抑制率的增長(zhǎng)趨勢(shì)大于孢子萌發(fā)抑制率。但相同濃度檸檬苦素對(duì)根霉孢子萌發(fā)抑制率始終大于菌絲生長(zhǎng)抑制率。因此,相同質(zhì)量濃度檸檬苦素對(duì)根霉孢子萌發(fā)具有更強(qiáng)的抑制作用,高濃度檸檬苦素對(duì)根霉菌絲才有較好的抑制作用。

表2 檸檬苦素對(duì)根霉的毒力回歸方程和EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 of limonoids against Rhizopus

圖1 檸檬苦素對(duì)根霉的菌絲和孢子萌發(fā)的抑制率

2.2 不同因素對(duì)檸檬苦素抑制根霉活性的影響

由圖2A、圖2C可知,經(jīng)過(guò)不同溫度和添加明膠的處理后,檸檬苦素對(duì)根霉的抑菌活性沒(méi)有顯著變化(p>0.05)。由圖2B可知,pH為4和6時(shí),檸檬苦素對(duì)根霉的抑菌活性最強(qiáng);隨著pH升高或降低,抑菌活性逐漸顯著減弱(p<0.05)。這與薤白乙醇提取物的抑菌活性受pH影響的研究結(jié)果一致[18]?？赡苁且?yàn)闄幟士嗨厝芤簆H接近4,環(huán)境的酸堿性改變會(huì)造成其變性,從而抑菌活性降低;而根霉受強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境影響較小,從而導(dǎo)致抑菌圈直徑變小。同時(shí),由圖2D可知,Fe3+、Fe2+均能顯著增強(qiáng)檸檬苦素的抑菌活性(p<0.05),且隨處理時(shí)間延長(zhǎng),增強(qiáng)作用比較穩(wěn)定。

圖2 不同因素對(duì)檸檬苦素抑制根霉活性的影響

2.3 檸檬苦素抑制根霉的機(jī)理

2.3.1 檸檬苦素對(duì)根霉菌絲總糖含量的影響 由圖3可知,對(duì)照菌絲體總糖含量為0.12%,經(jīng)質(zhì)量濃度為312.5 μg/mL的檸檬苦素處理后,根霉菌絲體總糖含量為0.11%,是對(duì)照菌絲體總糖含量的87.53%。隨著處理檸檬苦素溶液濃度的提高,菌絲體總糖含量降低。當(dāng)檸檬苦素質(zhì)量濃度為5000 μg/mL時(shí),菌絲體總糖含量?jī)H為0.04%,為對(duì)照菌絲體總糖含量的32.66%。經(jīng)Duncan方差分析,隨檸檬苦素處理濃度的增大,根霉菌絲體總糖含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(p<0.05)。說(shuō)明經(jīng)檸檬苦素處理后,根霉菌絲體內(nèi)糖外滲,且隨檸檬苦素濃度增高,外滲量增大,菌絲體總糖含量越低。

圖3 檸檬苦素濃度對(duì)根霉菌絲總糖含量的影響

2.3.2 檸檬苦素對(duì)根霉胞外可溶性蛋白含量的影響 由圖4可知,檸檬苦素處理組和對(duì)照組的胞外蛋白質(zhì)含量均呈上升,并逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì),但處理組胞外蛋白質(zhì)含量上升幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組。說(shuō)明15%乙醇和檸檬苦素均會(huì)導(dǎo)致根霉胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲出,但檸檬苦素的作用明顯更強(qiáng)。同時(shí)可知,處理組胞外蛋白質(zhì)含量在作用初期開(kāi)始迅速上升,處理時(shí)間為16 h時(shí),胞外蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高值,并小幅下降,趨于穩(wěn)定。說(shuō)明檸檬苦素迅速影響了根霉細(xì)胞膜的通透性,處理時(shí)間為16 h時(shí),胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲出已達(dá)最高值;且質(zhì)量濃度為625 μg/mL(MIC)的檸檬苦素對(duì)根霉的作用是抑制,并非殺滅[19],根霉可以利用胞外蛋白質(zhì)進(jìn)行一定的生長(zhǎng)代謝,因此,胞外蛋白質(zhì)含量會(huì)出現(xiàn)小幅波動(dòng)。

圖4 檸檬苦素對(duì)根霉胞外蛋白質(zhì)含量的影響

2.3.3 檸檬苦素對(duì)根霉菌液AKP活力的影響 堿性磷酸酶(AKP)是一種存在與細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的酶,當(dāng)細(xì)胞壁遭受破壞時(shí),AKP泄露,因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外AKP活力即可反映出細(xì)胞壁完整性[20]。由圖5可知,檸檬苦素處理組AKP活力從處理初期開(kāi)始呈持續(xù)上升趨勢(shì),在8 h后趨于穩(wěn)定,且AKP活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組。說(shuō)明檸檬苦素可以使根霉細(xì)胞壁的通透性發(fā)生了變化,導(dǎo)致根霉內(nèi)AKP大量滲出;且8 h后檸檬苦素對(duì)根霉細(xì)胞壁破壞作用已基本完成。

圖5 檸檬苦素對(duì)根霉菌液AKP活力的影響

2.4 電鏡分析

由圖6可知,在檸檬苦素作用后,根霉形態(tài)與對(duì)照組相比發(fā)生了明顯變化。對(duì)照組根霉的孢子(圖6A1和圖6B1)表面完整、光滑,形態(tài)較飽滿;菌絲(圖6C1)粗壯、表面光滑,無(wú)斷裂。2×MIC濃度檸檬苦素處理后的根霉孢子(圖6A2和圖6B2)凹陷嚴(yán)重,溶出物明顯,出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮現(xiàn)象;菌絲(圖6C2)出現(xiàn)斷裂扭曲、變形、變細(xì)。與對(duì)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破壞性以及對(duì)孢子、菌絲的抑制作用研究結(jié)果一致。

圖6 根霉掃描電鏡圖

3 結(jié)論

檸檬苦素對(duì)根霉的MIC和MBC分別為1250和5000 μg/mL;相同濃度下,孢子萌發(fā)抑制率大于菌絲生長(zhǎng)抑制率。檸檬苦素對(duì)根霉的抑菌活性不受加熱和明膠的影響,在弱酸性環(huán)境較強(qiáng),且Fe3+、Fe2+均能提高檸檬苦素的抑菌活性。因此,檸檬苦素比較適合在弱酸性的環(huán)境中應(yīng)用,并且可以應(yīng)用于富含F(xiàn)e3+、Fe2+和蛋白質(zhì),需要經(jīng)過(guò)高溫處理的食品中作為根霉的抑菌劑。進(jìn)一步對(duì)檸檬苦素抑菌機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn),檸檬苦素可以使根霉胞內(nèi)物質(zhì)大量滲出。隨著處理濃度增加,滲出量增大。且處理前期,處理時(shí)間越長(zhǎng),胞內(nèi)物質(zhì)滲出量越大;但到8和16 h時(shí),AKP和蛋白質(zhì)滲出量基本趨于穩(wěn)定。通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬苦素處理的根霉孢子出現(xiàn)變形,溶出物滲出明顯;菌絲發(fā)生細(xì)微斷裂扭曲、變形、變細(xì)。因此,檸檬苦素可以使根霉細(xì)胞變形、破裂,通過(guò)改變根霉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,使胞內(nèi)物質(zhì)滲出,從而抑制根霉的生長(zhǎng)。