白羽祥，史普酉，楊成翠，賈 孟，王 戈，楊煥文，徐照麗

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021）

烤煙是典型的忌連作作物，但在目前可耕地面積不斷減少的背景下，烤煙連作現(xiàn)象依然普遍。連續(xù)種植一定年限后植煙土壤理化性質(zhì)惡化［1-3］，微生物數(shù)量、功能和結(jié)構(gòu)多樣性失衡［4-5］，酶活性受抑［6-7］，最終導(dǎo)致諸如病蟲害加重、生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程受阻、產(chǎn)質(zhì)量降低等連作障礙現(xiàn)象的發(fā)生［8-9］。土壤中酚酸類自毒物質(zhì)積累被認(rèn)為在連作障礙中扮演重要角色［10-11］，其積累特征已在水稻、大豆、花生、黃瓜、中藥材以及林木等作物中予以初步明確［12-14］。目前，烤煙根系分泌物中已被鑒定出多種酚酸，并采用外源添加方法探討其對(duì)烤煙自身的化感效應(yīng)［15-18］，并依據(jù)其對(duì)烤煙種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)、抗氧化酶及病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響推測(cè)酚酸類物質(zhì)可能是導(dǎo)致烤煙連作障礙發(fā)生的重要因素［19-21］，但多數(shù)研究結(jié)論尚無直接證據(jù)［22-23］。

目前對(duì)連作土壤酚酸類物質(zhì)的研究尚處在分離鑒定階段［16-17］，酚酸類物質(zhì)在土壤中的變化趨勢(shì)和規(guī)律及其之間是否存在相互作用關(guān)系研究尚未涉及，這對(duì)研究酚酸類物質(zhì)在連作障礙中的作用機(jī)制具有十分重要的意義。在實(shí)際問題中，當(dāng)不能確定哪種曲線模型最接近樣本數(shù)據(jù)時(shí)，可以運(yùn)用曲線估計(jì)對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期明確最優(yōu)的曲線模型［24］；由于各酚酸類物質(zhì)之間具有復(fù)雜的關(guān)系，它們之間互相作用、互相影響［25］，雙變量相關(guān)性分析并不能反應(yīng)兩個(gè)變量之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用逐步回歸模型對(duì)各變量之間的相互影響關(guān)系進(jìn)行分析［26］。因此，本研究利用曲線估計(jì)和逐步回歸模型對(duì)植煙土壤酚酸類物質(zhì)在土壤中的變化趨勢(shì)及規(guī)律和酚酸類物質(zhì)之間的相互影響關(guān)系進(jìn)行分析。本試驗(yàn)以連作4、6、8、14和16年的植煙土壤為研究對(duì)象，在其他條件一致的情況下，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)各土樣的酚酸類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，研究連作年限對(duì)植煙土壤酚酸類物質(zhì)種類和含量的影響；利用曲線估計(jì)模型研究植煙土壤酚酸類物質(zhì)隨連作年限增加的變化趨勢(shì)及規(guī)律；在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，利用逐步回歸模型研究不同連作年限條件下植煙土壤中各酚酸類物質(zhì)之間的互相影響關(guān)系，旨在為研究酚酸類物質(zhì)在連作障礙中的作用機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 連作植煙土壤樣品采集

于2017年在保山市施甸縣姚關(guān)鎮(zhèn)陡坡村連片烤煙種植示范區(qū)（東經(jīng)99.22°，北緯24.56°）采集土樣，該區(qū)域土地由同一農(nóng)戶承包，土壤質(zhì)地為砂壤土，種植烤煙品種為K326，前茬作物為大麥，每年烤煙施氮（N）量為120 kg·hm-2，施磷（P2O5）量為90 kg·hm-2，施鉀（K2O）量為321 kg·hm-2，肥料由當(dāng)?shù)責(zé)煵莨咎峁耘喙芾泶胧┙y(tǒng)一按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行。

采取分別種植4年（T4）、6年（T6）、8年（T8）、14年（T14）和16年（T16）烤煙的0～20 cm土樣，每一種植年限土壤取3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)利用五點(diǎn)取樣法采集5個(gè)土壤樣品，除去表層后混勻。所取土樣分兩部分處理，一部分土樣研磨過2 mm篩裝入無菌封口袋后立即放入4℃冰箱中，用于酚酸類物質(zhì)的測(cè)定；另一部分土壤風(fēng)干，用于土壤理化性狀的測(cè)定，各處理土樣基本理化性狀見表1。

表1 各處理土樣基本理化性狀

1.2 土壤樣品處理及測(cè)定方法

土壤樣品處理及測(cè)定參照李培棟等［27］的方法并依據(jù)本試驗(yàn)實(shí)際情況改進(jìn)。每個(gè)處理稱取100 g新鮮樣品置于離心管中（3次重復(fù)），加入100 mL 1 mol·L-1NaOH放置24 h，然后震蕩60 min，離心后將過濾液用12 mol·L-1的HCl酸化至pH值為2.5，120 min后離心除去胡敏酸，然后將上清液過0.22 μm的纖維膜，濾液用高效液相色譜（HPLC）儀測(cè)定，結(jié)果按照烘干土重?fù)Q算。

土壤酚酸類化合物的測(cè)定采用HPLC法進(jìn)行。儀器為Aglient1200高效液相色譜儀，色譜柱為SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），條件為流速1 mL·min-1，柱溫為25oC，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。流動(dòng)相A（甲醇）和流動(dòng)相B（pH=2.5的乙酸水溶液）設(shè)置的具體梯度為：0 min，流動(dòng)相A為30%，B為70%；15 min，流動(dòng)相A為50%，B為50%；16 min，流動(dòng)相A 為70%，B為30%；30 min，流動(dòng)相A為0%，B為100%。標(biāo)準(zhǔn)樣品分別為闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、間苯三酚、香草酸、香蘭素、阿魏酸、鄰苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水楊酸，進(jìn)樣量為10 μL。每個(gè)周期分析結(jié)束后，等待10 min，以便去除干擾成分的影響，保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Office 2013進(jìn)行初步處理和作圖；采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用 Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較和分析；利用曲線估計(jì)模型研究酚酸類物質(zhì)的變化趨勢(shì)和規(guī)律［24］；利用逐步回歸模型對(duì)酚酸類物質(zhì)間相互作用關(guān)系進(jìn)行分析［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連作年限植煙土壤酚酸類物質(zhì)種類和含量分析

標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣共10種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、對(duì)羥基苯甲酸、闊馬酸、香草酸、阿魏酸、香蘭素、苯甲酸、鄰苯二甲酸、肉桂酸和水楊酸（圖1），在5個(gè)處理中均檢出了8種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸（圖2）。

隨連作年限增加，植煙土壤中間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸和酚酸類物質(zhì)總含量升高（圖 3 a、b、c、d、e、f、i）；而苯甲酸和肉桂酸含量呈先升高后降低趨勢(shì)（圖3 g、h）?？傮w而言，植煙土壤酚酸類物質(zhì)隨連作年限增加呈現(xiàn)出積累特征。

圖1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

圖3 連作對(duì)各酚酸類物質(zhì)含量的影響

2.2 基于曲線估計(jì)的酚酸類物質(zhì)積累特征分析

由2.1可知，連作植煙土壤檢測(cè)出的8種酚酸物質(zhì)中有6種呈現(xiàn)出積累趨勢(shì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素和阿魏酸。以連作年限為自變量（t）、酚酸類物質(zhì)含量為因變量（Y），利用曲線估計(jì)模型對(duì)各酚酸類物質(zhì)含量變化規(guī)律進(jìn)行擬合，從擬合結(jié)果來看，間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素的6個(gè)擬合曲線決定系數(shù)大小均以增長(zhǎng)曲線最高，而阿魏酸的擬合曲線決定系數(shù)大小以冪函數(shù)最高（表2）。因此，間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素含量在連作條件下以增長(zhǎng)曲線趨勢(shì)積累；阿魏酸含量在連作條件下則以冪函數(shù)趨勢(shì)積累（表 3）。

表2 具積累趨勢(shì)酚酸的曲線估計(jì)

表3 具積累趨勢(shì)酚酸的優(yōu)選模型

2.3 各種酚酸類物質(zhì)含量大小比較

5個(gè)處理中8種酚酸類物質(zhì)的含量大小在前3位的分別為間苯三酚、對(duì)羥基苯甲酸和香蘭素，且顯著高于其他酚酸類物質(zhì)（圖4），說明連作對(duì)間苯三酚、對(duì)羥基苯甲酸和香蘭素這3種酚酸類物質(zhì)含量的影響較其他酚酸類物質(zhì)大。

圖4 各種酚酸類物質(zhì)含量

2.4 基于逐步回歸模型的酚酸類物質(zhì)相互影響關(guān)系分析

相關(guān)性分析表明，不同酚酸類物質(zhì)間相關(guān)性存在差異（表4）。除苯甲酸與其他酚酸類物質(zhì)間低度相關(guān)外，其余酚酸類物質(zhì)間均具中、高度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系。逐步回歸分析的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)大小代表對(duì)應(yīng)自變量影響力大小，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)的正負(fù)則分別代表了該自變量對(duì)因變量起促進(jìn)或抑制的影響作用［26］。因此，在相關(guān)性分析基礎(chǔ)上，利用逐步回歸模型對(duì)各酚酸類物質(zhì)之間的相互影響關(guān)系進(jìn)行分析，從結(jié)果來看，剔除無關(guān)變量后，篩選出了間苯三酚、阿魏酸、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素的回歸方程（表5），說明這6種酚酸含量受其他酚酸的影響，其余酚酸（苯甲酸和肉桂酸）含量不受其他酚酸影響或影響不顯著。其中，間苯三酚和阿魏酸含量之間具顯著的相互促進(jìn)作用；阿魏酸對(duì)闊馬酸含量具促進(jìn)作用；香草酸對(duì)對(duì)羥基苯甲酸含量具促進(jìn)作用；香蘭素對(duì)香草酸含量具促進(jìn)作用，而苯甲酸具抑制作用，且促進(jìn)作用大于抑制作用；香草酸和苯甲酸對(duì)香蘭素均具促進(jìn)作用，且香草酸的影響力小于苯甲酸（表 5）。

表4 各酚酸類物質(zhì)及其總含量相關(guān)性分析

表5 各酚酸類物質(zhì)間的逐步回歸方程

3 討論

本研究在不同連作年限植煙土壤中檢測(cè)出8種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，相對(duì)于前人在花生［28］、蘋果［29］、草莓［30］、和楊樹［31］連作土壤中檢測(cè)出的酚酸種類而言多出3到4種，說明不同作物的連作土中酚酸類物質(zhì)種類有一定差異。土壤酚酸類物質(zhì)積累是引起作物連作障礙的重要原因之一［10-11］，孫海兵等［29］對(duì)蘋果園的連作土壤研究發(fā)現(xiàn)，非連作土壤中酚酸類物質(zhì)含量顯著少于連作土；李賀勤等［30］對(duì)草莓連作土壤研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸和肉桂酸含量隨連作年限增加顯著升高。本試驗(yàn)得出相似結(jié)論，5個(gè)處理中的間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、香蘭素的含量和酚酸類物質(zhì)總含量均隨連作年限增加而升高；對(duì)于苯甲酸和肉桂酸而言，其含量變化隨連作年限增加呈先升高后降低趨勢(shì)，但譚秀梅等［31］在楊樹連作土中研究發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)表現(xiàn)為增加趨勢(shì)，這可能是種植作物和連作年限的長(zhǎng)短不同造成的，具體原因還有待進(jìn)一步探究。盡管土壤微生物在一定程度上會(huì)降解酚酸類物質(zhì)［32-34］，但連作條件下酚酸類物質(zhì)仍呈積累趨勢(shì)［27，29-30］，而前人并未針對(duì)不同種類酚酸的積累趨勢(shì)和規(guī)律進(jìn)行研究，在通過外源添加的方式研究酚酸類物質(zhì)的化感作用時(shí)，往往不是基于田間實(shí)測(cè)值設(shè)定酚酸濃度［35］，而探明不同種類酚酸隨連作年限增加的變化趨勢(shì)和規(guī)律對(duì)研究酚酸類物質(zhì)在連作障礙中的作用機(jī)制具有十分重要的意義。本研究利用曲線估計(jì)模型，發(fā)現(xiàn)間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素含量在連作條件下以增長(zhǎng)曲線趨勢(shì)積累，阿魏酸含量在連作條件下以冪函數(shù)趨勢(shì)積累。因此，酚酸類物質(zhì)在連作條件下積累模型的建立對(duì)外源添加酚酸類物質(zhì)的試驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義，可基于田間酚酸類物質(zhì)的絕對(duì)含量并借助模型設(shè)定外源添加酚酸類物質(zhì)的含量。

通過對(duì)5個(gè)處理中8種酚酸類物質(zhì)的含量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)間苯三酚、對(duì)羥基苯甲酸和香蘭素的含量明顯高于其他物質(zhì)，但考慮到酚酸類物質(zhì)之間的協(xié)同作用、拮抗作用以及各種酚酸類物質(zhì)之間的綜合作用，單靠某一種物質(zhì)含量的高低來說明其產(chǎn)生作用的大小有失偏頗，因此，對(duì)酚酸類物質(zhì)在連作障礙中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和探索。Blum［25］提出，化感物質(zhì)會(huì)共同作用于植物而產(chǎn)生復(fù)合效應(yīng)，即協(xié)同、拮抗和累加作用。王璞等［36］通過外源添加酚酸的方式對(duì)棉花種子萌發(fā)的研究表明，對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸之間具有顯著的協(xié)同作用，但沈荔花［37］對(duì)加拿大一枝黃花（Solidagocanadensis L.）的研究表明酚酸各組分之間存在拮抗作用。由此可見，前人是通過研究酚酸類物質(zhì)對(duì)作物產(chǎn)生的效應(yīng)來直接研究其拮抗或協(xié)同作用的。在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究通過逐步回歸模型研究某些酚酸類物質(zhì)對(duì)某種酚酸含量的影響來間接表明兩者之間是否存在協(xié)同或拮抗作用。逐步回歸分析表明，部分酚酸類物質(zhì)含量之間存在促進(jìn)或抑制作用，具體表現(xiàn)為：間苯三酚和阿魏酸含量之間存在互相促進(jìn)的關(guān)系；阿魏酸對(duì)闊馬酸含量有促進(jìn)作用；香草酸對(duì)對(duì)羥基苯甲酸含量有促進(jìn)作用；香蘭素對(duì)香草酸含量有促進(jìn)作用，而苯甲酸對(duì)其含量則存在抑制作用，且香蘭素的促進(jìn)作用大于苯甲酸的抑制作用；香草酸和苯甲酸對(duì)香蘭素含量有促進(jìn)作用，且香草酸的促進(jìn)作用小于苯甲酸。以上結(jié)果說明部分酚酸類物質(zhì)含量間存在顯著的促進(jìn)或抑制作用，為進(jìn)一步研究酚酸類物質(zhì)間的相互作用提供了一定的理論依據(jù)，但因研究方法和技術(shù)的限制，目前對(duì)酚酸類物質(zhì)間的相互作用關(guān)系研究尚屬摸索階段，還需進(jìn)一步研究和探討。

4 結(jié)論

連作植煙土壤中共檢出8種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，且不同酚酸類物質(zhì)含量之間存在差異。

連作條件下，植煙土壤酚酸類物質(zhì)呈積累特征；曲線估計(jì)分析表明，間苯三酚、闊馬酸、對(duì)羥基苯甲酸、香蘭素和香草酸含量以增長(zhǎng)曲線趨勢(shì)積累，阿魏酸含量以冪函數(shù)趨勢(shì)積累。

逐步回歸分析表明，部分酚酸類物質(zhì)之間相互影響，且存在不同程度的促進(jìn)或抑制作用。