黃澤瑋　劉忠瑩　黃瑛　杜鋼　賀亞玲

摘要：建立基于Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜的快速篩查及確證減肥及壯陽(yáng)類保健食品和中成藥中54種非法添加物的方法。采用Hypersil GOLD C18 column色譜柱（150mm×2.1mm，1.9μm），梯度洗脫，流量0.3mL/min，正離子全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描模式，在28min內(nèi)完成54種目標(biāo)化合物的分離和高精度一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜掃描，并通過(guò)Exact Finder 2.0軟件進(jìn)行快速篩查，以確證樣品中是否摻加減肥及壯陽(yáng)類化學(xué)藥物。結(jié)果顯示在28min內(nèi)54種化合物能得到較好分離;6種基質(zhì)加標(biāo)溶液中54種化合物的一級(jí)與二級(jí)離子精確質(zhì)量數(shù)的實(shí)測(cè)值與理論值均在5×10^-6誤差之內(nèi);空白溶液中54種化合物結(jié)果均為陰性;20批減肥及壯陽(yáng)類保健食品及中成藥樣品中檢出1批陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率5%0該方法操作簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果定性準(zhǔn)確，無(wú)假陰性和假陽(yáng)性情況出現(xiàn)，可用于減肥及壯陽(yáng)類保健食品和中成藥中54種非法添加的高通量快速篩查及確證。

關(guān)鍵詞：Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜;非法添加;快速篩查;減肥;壯陽(yáng)

中圖分類號(hào)：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2019）01-0070-07

0 引言

近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對(duì)保健食品及中成藥的需求與日俱增，其中減肥及壯陽(yáng)類相關(guān)產(chǎn)品尤其受到人們的青睞。然而這一類產(chǎn)品中檢出非法添加的情況時(shí)有發(fā)生。近年來(lái)許多不法商家為謀取暴利，在該類產(chǎn)品中添加化學(xué)成分，為消費(fèi)者埋下了健康隱患。因此，為嚴(yán)厲打擊非法添加行為，保證人民群眾的生命安全，需要開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、高選擇性的方法用于減肥及壯陽(yáng)類非法添加的檢測(cè)。

目前常用的非法添加檢驗(yàn)方法主要有薄層色譜法[1]、液相色譜法[2-3]和低分辨液質(zhì)聯(lián)用法[4-5]，其存在選擇性差、干擾多、定性能力弱等缺點(diǎn)。Orbitrap是近20多年來(lái)質(zhì)譜分析器的突破性技術(shù)，通過(guò)靜電場(chǎng)軌道肼方式提供高質(zhì)量分辨能力和精確質(zhì)量數(shù)[6]，可在有限的時(shí)間范圍對(duì)數(shù)量龐大的化合物進(jìn)行篩查。其最高分辨率可達(dá)24萬(wàn)以上，質(zhì)量精度可達(dá)10^-7～10^-6。有報(bào)道使用Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)降糖類中成藥和保健食品中的非法添加化學(xué)藥物[7]以及動(dòng)物肌肉中的β2受體激動(dòng)劑[8]進(jìn)行檢測(cè)。本文將Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜技術(shù)用于減肥及壯陽(yáng)類保健食品及中成藥中54種非法添加物的快速篩查及確證。通過(guò)全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（FullMS/dd-MS²）模式，在28min內(nèi)完成對(duì)樣品的分離和高精度一級(jí)、二級(jí)掃描，并通過(guò)Exact Finder2.0軟件進(jìn)行快速篩查和確證。本方法具有快速、準(zhǔn)確、高選擇性的特點(diǎn)，為打擊日益猖撅的非法添加行為提供了新手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo FisherScientific），裝配有HESI-II源：Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 對(duì)照品

鹽酸苯丙醇胺、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、鹽酸安非他酮、鹽酸芬氟拉明、鹽酸氟西汀、鹽酸西布曲明、辛伐他汀、非諾貝特來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所;安非他明硫酸鹽、鹽酸甲基安非他明、吲達(dá)帕胺、酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、比沙可啶、洛伐他汀、奧利司他、煙酸、茶堿、那紅地那非、紅地那非、氨基他達(dá)拉非、西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;鹽酸氯卡色林、布美他尼、利莫那班鹽酸鹽、鹽酸去甲氟西汀、美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、西立伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、依替米貝、阿伐麥布、鹽酸去甲芬氟拉明、琉基西地那非、去甲基他達(dá)拉非來(lái)源于Toronto Research Chemicals INC.;芐基西布曲明鹽酸鹽、鹽酸豪莫西布曲明、鹽酸氯代西布曲明、他達(dá)拉非、羥基豪莫西地那非、鹽酸伐地那非、硫代豪莫西地那非、烏地那非、二甲基西地那非、羥基硫代豪莫西地那非來(lái)源于TLC PharmaChem;去甲偽麻黃堿鹽酸鹽、分特拉明來(lái)源于SIGMA-Alorch company;左旋肉堿來(lái)源于LGC Gmbh;純度均>94%。1.3試劑及耗材

甲醇、甲酸銨（色譜級(jí)）：Fisher Chemical;甲酸（優(yōu)級(jí)純）：Anpel;Pierce^TMLTQ Velos ESI PositiveIon Calibration Solution（質(zhì)譜校正液：含有咖啡因，MRFA，Ultramark 1621，正丁胺）：Thermo FisherScientific;20批保健食品及中成藥樣品：四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院市場(chǎng)抽樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)處理

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18 column（150mm×2.1mm，1.9μm），Thermo Fisher Scientific：流量0.3mL/min;流動(dòng)相為5mmol/L的甲酸銨溶液（A相，含0.1%甲酸）-0.1甲酸甲醇（B相）;梯度洗脫：0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40）→14min（60：40）→16min（40：60）→17min（5：95）→25min（5：95）→25.1min（95：5）→28min（95：5）;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：2μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用HESI-Ⅱ源（正離子模式），噴霧電壓為3.6kV，毛細(xì)管和霧化器溫度均為350℃。鞘氣和輔助氣分別為4.5L/min和6.5L/min，S-lens RF level為60%。霧化氣為氮?dú)?，碰撞氣為氦氣。使用質(zhì)譜校正液5d校正1次質(zhì)量軸。掃描方式采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（Full MS/dd-MSZ）模式，此模式包含1次全掃描（分辨率30000）和1次數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（分辨率15000）。一級(jí)全掃描范圍為100～700m/z，自動(dòng)增益控制和離子注人時(shí)間分別設(shè)為1.0×10⁶和100ms;數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（dd-MS²）使用動(dòng)態(tài)排除（Dynamic Exclusion）功能，具體參數(shù)：Repeat count設(shè)為2，Repeat duration設(shè)為4.0s，Exclusion list size設(shè)為500，Exclusion duration設(shè)為6.0s：Minimum signal threshold設(shè)為1000count;Analyze top N peaks設(shè)為10;Activation type設(shè)為CID：Isolation window設(shè)為2.0m/z;ActivationQ設(shè)為0.250;Activation time設(shè)為10.00ms;針對(duì)每個(gè)目標(biāo)化合物分別設(shè)置最佳歸一化碰撞能量，詳見(jiàn)表1。

2.1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Exact Finder 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將54種化合物的保留時(shí)間、一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)錄入軟件，形成數(shù)據(jù)庫(kù)，用于定性篩查和確證：在Screening Method中設(shè)置目標(biāo)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)：以化合物保留時(shí)間和一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)作為篩查依據(jù)，以二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)作為確證依據(jù);樣品與對(duì)照品的一級(jí)及二級(jí)離子精確質(zhì)量數(shù)偏差應(yīng)≤5×10^-6，峰閾值、S/N信噪比閾值分別設(shè)為400和5;保留時(shí)間窗設(shè)置為15s。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱取54種化合物的對(duì)照品各約10mg，分別置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，作為混合對(duì)照工作液。

2.2.2 供試品溶液

固體制劑（膠囊取內(nèi)容物）：研磨均勻后，精密稱取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇約8mL，超聲30min，放置至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得。液體制劑：精密稱取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3 結(jié)果

空白溶液的總離子流圖如圖1所示，在12.16，14.55min雖有峰出現(xiàn)（其一級(jí)質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖2，圖3），但是其一級(jí)質(zhì)譜對(duì)各化合物的檢測(cè)無(wú)干擾。混合對(duì)照品工作液中54種化合物的總離子流圖如圖4所示，分析物峰形良好，54種化合物均能得到較好分離。其中6組同分異構(gòu)體均能通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行區(qū)分。單次測(cè)定在28min內(nèi)可完成54種化合物的篩查，通過(guò)Exact Finder進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析效率高。化合物保留時(shí)間、一級(jí)與二級(jí)離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和最佳歸一化碰撞能量如表1所示?？捎^察到對(duì)照品溶液中54種化合物的實(shí)測(cè)與理論質(zhì)量數(shù)偏差均小于5×10^-6，顯示了Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜高度可靠的質(zhì)量精度。

以甲醇逐級(jí)稀釋各混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取2μL進(jìn)樣。在進(jìn)樣濃度盡可能低的情況下，以保證連續(xù)三針進(jìn)樣定性正確（實(shí)測(cè)一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的偏差均≤5×10^-6）來(lái)確定檢出限;檢出限的結(jié)果見(jiàn)表1，54種化合物的檢出限均小于10μg/g;以進(jìn)樣六針檢出限溶液中各化合物峰面積的RSD表示精密度，精密度RSD（詳見(jiàn)表1）均小于20%。

選擇陰性的保健食品及中成藥（包括片劑、膠囊劑、茶劑、酒、顆粒劑、咖啡）共6種基質(zhì)，分別稱取樣品1g，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，使供試品溶液最終濃度為各化合物檢出限濃度，與供試品溶液同法制備后進(jìn)樣測(cè)定。經(jīng)Exact Finder數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示，六種基質(zhì)加標(biāo)溶液中54種化合物的一級(jí)與二級(jí)離子精確質(zhì)量數(shù)的實(shí)測(cè)值與理論值均在5×10^-6誤差之內(nèi)，無(wú)假陰性情況。同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，54種化合物結(jié)果均為陰性，無(wú)假陽(yáng)性情況。

2.4 方法的應(yīng)用

將建立的方法用于非法添加檢測(cè)工作。所篩查的化合物基本囊括了現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)壯陽(yáng)類和減肥類非法添加的化合物種類，另外還增加了部分壯陽(yáng)或減肥作用的化合物以擴(kuò)大篩查范圍。樣品按“2.2.2”項(xiàng)方法處理后，進(jìn)樣2μL，Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，得到數(shù)據(jù)在Exact Finder 2.0軟件進(jìn)行快速篩查和確證。在20批減肥及壯陽(yáng)中成藥和保健食品中共檢出1批陽(yáng)性樣品。陽(yáng)性率5%，檢出的非法添加物為西布曲明，總離子流圖見(jiàn)圖5，西布曲明一級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，西布曲明二級(jí)碎片離子圖見(jiàn)圖7。按照BJS201701《食品中西布曲明等化合物的測(cè)定》對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，定性結(jié)果與本方法一致。

3 討論

3.1 同分異構(gòu)體

54種目標(biāo)化合物中存在6組同分異構(gòu)體。其中三組為光學(xué)異構(gòu)體（苯丙醇胺（5.5min）-去甲偽麻黃堿（6.2min），麻黃堿（7.5min）-偽麻黃堿（7.7min），甲基安非他明（9.0min）-分特拉明（9.4min）），其一級(jí)與二級(jí)碎片精確質(zhì)量數(shù)均一致，在定性上需要通過(guò)保留時(shí)間來(lái)區(qū)分，因此在梯度洗脫的設(shè)計(jì)上，前10min采用較緩的梯度（0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40））以保證上述光學(xué)異構(gòu)體在色譜行為上做到徹底分離，相互不干擾;另外還存在3組同分異構(gòu)體（偽伐地那非（18.2min）-那莫西地那非（18.9min），伐地那非（11.6min）-二甲基西地那非（12.5min），硫代艾地那非（16.9min）-硫代豪莫西地那非（17.2min）），在保留時(shí)間不同的同時(shí)，選擇定性離子時(shí)避免選擇相同質(zhì)量的碎片離子，以保證定性的準(zhǔn)確性。

3.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

研究對(duì)比了Thermo Hypersil GOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）、Thermo Acclaim RSLCC18（2.1mm×100mm，2.2μm）、Agilent ZORBAXEclipse XDB-C8（2.1mm×50mm，1.8μm）等色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果。最終選擇Thermo HypersilGOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）色譜柱，其對(duì)于中段出峰密集階段（10～16min）也可以做到所有化合物基本分離，且峰形良好。

在Full MS/dd-MS²掃描模式中，當(dāng)全掃描數(shù)據(jù)中出現(xiàn)與目標(biāo)化合物一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)相匹配的質(zhì)量數(shù)時(shí)觸發(fā)二級(jí)掃描，按照各化合物給定的最佳歸一化碰撞能量進(jìn)行二級(jí)碎裂，獲得的二級(jí)碎片離子作為確證離子，用于確證化合物的定性。使用FullMS/dd-MS²數(shù)據(jù)掃描可減少非目標(biāo)信息的采集，提高目標(biāo)信息的準(zhǔn)確度和分辨率。其中還使用了動(dòng)態(tài)排除功能，其作用是某一信號(hào)在4s內(nèi)被掃描到2次后，將信號(hào)放進(jìn)排除列表，在接下來(lái)的6s內(nèi)若再掃描到該信號(hào)不再進(jìn)行二級(jí)碰撞，其意義在于避免響應(yīng)高化合物的重復(fù)掃描，增加掃描的化合物個(gè)數(shù)，尤其是響應(yīng)相對(duì)較低的化合物。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[9-12]，在非法添加分析中，普遍采用有機(jī)試劑+超聲提取的方式前處理。常用的有機(jī)溶劑便是甲醇、乙腈和一定比例的甲醇和水，故考察了甲醇、乙腈、50%甲醇的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種溶劑提取后，各化合物的回收率無(wú)顯著差異;通過(guò)對(duì)陽(yáng)性樣品的提取比較，結(jié)果無(wú)明顯差異?？紤]操作方便、成本、環(huán)保和對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康影響（乙腈毒性比甲醇大）等因素，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢出限的確定

從非法添加的角度，一般都會(huì)超量添加化學(xué)成分，從藥效學(xué)角度出發(fā)，太低的添加濃度也不具有藥效學(xué)意義;另外若使用3倍信噪比的方式來(lái)確定檢出限，本方法檢出限會(huì)降低至現(xiàn)有水平的百分之一～千分之一，但是在這樣的檢出限水平下，即使是純對(duì)照品溶液，也可能會(huì)出現(xiàn)假陰性的情況。因此本實(shí)驗(yàn)中，一方面所確定的檢出限均能滿足各化合物最低起效劑量，另一方面通過(guò)在進(jìn)樣濃度盡可能低的情況下，以保證連續(xù)三針進(jìn)樣定性正確來(lái)確定檢出限。這種方式能有效保證定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免出現(xiàn)假陰性。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文將Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜技術(shù)用于保健食品及中成藥中的減肥及壯陽(yáng)類化學(xué)藥物的快速篩查和確證。采用Full MS/dd-MS²模式，在28min內(nèi)完成對(duì)樣品中分析物的分離和高精度一級(jí)、二級(jí)掃描，并以Exact Finder 2.0軟件進(jìn)行快速篩查和確證。方法操作簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果定性準(zhǔn)確，無(wú)假陰性和假陽(yáng)性情況出現(xiàn)。在20批減肥及壯陽(yáng)類保健食品及中成藥中檢出1批陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為5%。Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜具有快速、準(zhǔn)確、高選擇性的特點(diǎn)，為打擊日益猖撅的非法添加行為提供了新工具、新技術(shù)。

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