謝玲,翟若男,高崇婷,薛瑞,桂定坤2,
(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海市第六人民醫(yī)院東院 腎臟風(fēng)濕科, 上海 201306;3. 上海交通大學(xué) 附屬第六人民醫(yī)院 腎內(nèi)科, 上海 200233)
糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病并發(fā)癥中最具破壞性的微血管疾病之一,它是終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)和腎功能衰竭的主要原因[1].病情進(jìn)入DN期,腎臟的體積會(huì)變大,還會(huì)因出現(xiàn)腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)增厚、腎小球硬化等癥狀而導(dǎo)致腎臟功能受損[2-3].臨床研究表明,DN病人會(huì)因腎臟功能受損而出現(xiàn)蛋白尿[4].足細(xì)胞是位于腎小球基底膜外表面的一種高度專一的細(xì)胞,有助于維持腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能[5].足細(xì)胞損傷可能導(dǎo)致腎功能出現(xiàn)異常,如出現(xiàn)DN蛋白尿[6].足細(xì)胞的損傷過程涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),足細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化時(shí)上皮細(xì)胞會(huì)失去其標(biāo)志性的上皮特征,具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征.足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程會(huì)造成足細(xì)胞損傷,從而加重DN進(jìn)展[7-8].關(guān)于足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化治療DN的相關(guān)機(jī)制仍有待研究.
DN不僅會(huì)使患者身體和心靈遭受痛苦,還會(huì)造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),20%~30%的糖尿病患者會(huì)進(jìn)展為DN,DN是目前公共衛(wèi)生重大問題之一[9].因此,防治DN具有重要意義.目前臨床常用治療DN的方法效果并不佳,血壓、血糖等對(duì)癥治療方法都達(dá)不到很好的療效,故病情會(huì)持續(xù)進(jìn)展,等病情進(jìn)展至后期則只能通過透析治療來緩解癥狀、維持生命.中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)、治療此類疾病具有獨(dú)特的思路與優(yōu)勢(shì).DN屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”、“水腫”等范疇,病機(jī)特點(diǎn)被認(rèn)為是本虛標(biāo)實(shí),活血化瘀是其基本治法,應(yīng)貫穿于DN治療的全過程.《本草綱目》記載,使用歷史悠久的中藥三七,具有“止血, 散血, 定痛”的功效[10].現(xiàn)代藥理研究亦表明, 三七具有止血、活血的雙向調(diào)節(jié)作用.比如,銀可絡(luò)聯(lián)合三七顆粒和黃芪顆粒具有改善血瘀脈絡(luò)型DN癥狀的作用[11].但是,三七顆粒治療DN的具體作用機(jī)制尚未闡明.本研究旨在探討三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠的腎臟保護(hù)作用和足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的影響,觀察其對(duì)腎臟足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白:骨架蛋白(desmin)、腎病蛋白(nephrin)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達(dá)的影響,從而更好地闡明三七對(duì)腎臟足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的保護(hù)作用機(jī)制,為防治DN提供新的思路和方法.
8周齡清潔級(jí)雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠24只,體質(zhì)量為(200±20)g,由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2010-0001).動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全程在上海市第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行.操作規(guī)范均遵照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》、《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,并通過上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn).三七顆粒購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司;desmin 兔抗大鼠一抗、nephrin兔抗大鼠一抗、α-SMA兔抗大鼠一抗和山羊抗兔二抗抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司;鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)、蘇木素染液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;二甲苯、乙醇、戊巴比妥鈉、戊二醛、四氧化蛾、環(huán)氧樹脂Epon 812購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;山羊血清購(gòu)于上海碧云天科技有限公司;中性樹膠購(gòu)于寧波諾德生物有限公司;Hitachi 7600-120E全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于日本Hitachi公司;Accu-Chek Ad-vantage羅氏血糖儀購(gòu)于德國(guó)羅氏公司;Philip CM-120透射電鏡購(gòu)于荷蘭Philip公司;Leica DMi8熒光倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司.
8周齡雄性SD大鼠24只,適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周,隨機(jī)選取8只大鼠作為對(duì)照組.剩余大鼠1次性腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55 mg/kg的STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病大鼠模型,注射STZ 72 h后尾靜脈檢測(cè)空腹血糖,濃度均≥16.7 mmol/L,故認(rèn)為1型糖尿病大鼠模型建立成功.造模成功的糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為模型組(n=8),三七顆粒組(n=8).臨床試驗(yàn)中,每人每天口服質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 g/kg的三七顆粒[11],根據(jù)劑量換算公式[12]進(jìn)行換算,三七顆粒組大鼠每天給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4 g/kg的三七顆粒水溶液灌胃,對(duì)照組及模型組均灌胃等體積蒸餾水,鑒于課題組前期中藥治療糖尿病腎病大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)驗(yàn)[13],實(shí)驗(yàn)選擇連續(xù)灌胃干預(yù)12周.
用大鼠代謝籠收集灌胃干預(yù)12周末大鼠24 h尿液,所收集的大鼠尿液于4 ℃ 1 000 r/min離心5 min,棄去沉渣,留取上清液,采用Hitachi 7600-120E全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿微量白蛋白、尿肌酐水平.
灌胃干預(yù)12周后,剪去大鼠尾尖小部分,擦拭掉大鼠的第1滴血,使用羅氏血糖儀檢測(cè)第2滴血的血糖,記錄數(shù)據(jù).灌胃干預(yù)12周后,腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,腹主動(dòng)脈取血, 于4 ℃ 1 500 r/min 離心15 min后取上清液,采用Hitachi 7600-120E全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠的血肌酐水平.
灌胃干預(yù)12周后,腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉處死后,迅速剝離腎臟,去除包膜,沿腎蒂剖開腎臟,迅速分離皮質(zhì)髓質(zhì).將部分腎組織迅速固定于體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液中,脫水,石蠟包埋,切成厚度為2 μm的薄片,根據(jù)蘇木精-伊紅染色法(HE)和過碘酸雪夫氏染色法(PAS)進(jìn)行染色,通過熒光倒置顯微鏡觀察腎臟組織病理變化.
取部分腎臟皮質(zhì)組織切成1×1×1 mm3的小塊,迅速固定于體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中,并置于4 ℃冰箱中保存.后用體積分?jǐn)?shù)為1%的四氧化蛾固定,常規(guī)逐級(jí)脫水,環(huán)氧樹脂Epon 812包埋,聚合后切成厚度為2.0 μm的切片.通過透射電鏡觀察腎臟足細(xì)胞足突的狀態(tài).
腎組織石蠟切片60 ℃ 烘片30 min,二甲苯浸沒兩次,每次10 min,無水乙醇浸沒兩次,每次5 min,體積分?jǐn)?shù)分別為95%、90%、80%的乙醇各浸沒5 min,常規(guī)逐級(jí)脫蠟,在沸水浴中對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉30 min.孵育desmin一抗、nephrin一抗、α-SMA一抗,于4 ℃過夜.之后,TBST清洗3次,每次5 min,于37 ℃孵育二抗1 h.之后,TBST清洗3次,每次5 min.DAB顯色,在顯微鏡下觀察組織變?yōu)樽攸S色后,雙蒸水終止顯色.后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染,雙蒸水清洗后,對(duì)切片進(jìn)行脫水、透明,最后用中性樹膠封片,熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果.
本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料的組間檢驗(yàn)采用單因素方差分析.P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.
大鼠的日常飲食結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組飲食明顯增多,但卻更消瘦,符合糖尿病的臨床表現(xiàn).與模型組比較,給藥末期三七顆粒組大鼠總體體質(zhì)量有所增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表 1).與模型組比較,三七顆粒組大鼠的血糖有所降低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1),表明三七顆粒沒有降低血糖的作用.血肌酐檢測(cè)結(jié)果顯示,3組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖 1A),表明三七顆粒沒有明顯的腎毒性.與對(duì)照組比較,模型組大鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐的值顯著升高(P<0.05)(圖 1B);與模型組比較,三七顆粒組大鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐的值顯著下降(P<0.05),表明三七顆粒具有降低糖尿病模型大鼠尿微量白蛋白/尿肌酐的值的作用.
表1 三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠體質(zhì)量、血糖的影響
Table 1 Effects of Panax notoginseng granule on weight and blood glucose in diabetic model rats
m/gc/(mmol·L-1)439.00±26.276.350±0.741293.50±51.581)19.138±7.2541)319.00±43.3312.675±6.459
1)與對(duì)照組比較,P<0.05.
1)Compare with control group,P<0.05.
A:血肌酐水平的比較,B:尿微量白蛋白與尿肌酐的質(zhì)量比.1)與對(duì)照組比較,P<0.05,2)與模型組比較,P<0.05.
A:Comparison of serum creatinine levels; B:Comparison of urinary microalbumin/urinary creatinine ratio. 1)Compare with control group,P<0.05;2)Compare with model group,P<0.05.
圖1 三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠血肌酐和尿微量白蛋白/尿肌酐的影響
Fig.1 Effect of Panax notoginseng granule on serum creatinine and urinary microalbumin/ urinary creatinine in diabetic model rats
大鼠腎臟標(biāo)本的HE染色和PAS染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠的腎小球基底膜明顯增厚,系膜基質(zhì)增生面積率明顯增加,病理改變明顯(P<0.05).與模型組比較,三七顆粒組大鼠的系膜基質(zhì)增生面積率明顯減少(P<0.05)(圖2),表明三七顆粒能夠改善糖尿病模型大鼠腎臟組織腎小球系膜基質(zhì)增生的病理改變.
透射電鏡下觀察大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟足細(xì)胞足突融合的數(shù)量明顯增多(P<0.05).與模型組比較,三七顆粒組大鼠腎臟足細(xì)胞足突融合的數(shù)量顯著減少(P<0.05),表明三七顆粒治療能夠改善糖尿病模型大鼠腎臟足細(xì)胞足突融合的病理改變(圖3).
免疫組化法檢測(cè)大鼠腎臟組織中足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白desmin、nephrin和α-SMA表達(dá)的結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎臟組織中desmin蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá)明顯上升(P<0.05),nephrin蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05).與模型組比較,三七顆粒組大鼠腎臟組織中desmin蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá)顯著下降(P<0.05),nephrin蛋白的表達(dá)顯著上升(P<0.05)(圖4).上述結(jié)果表明,三七顆??筛纳铺悄虿∧P痛笫竽I組織足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的異常狀態(tài),緩解足細(xì)胞損傷.
A:HE染色和PAS染色結(jié)果,B:HE半定量分析,C:PAS半定量分析.1)與對(duì)照組比較,P<0.05,2)與模型組比較,P<0.05.
A:Results of HE staining and PAS staining; B: Semi-quantitative analysis of HE staining; C:Semi-quantitative analysis of PAS staining. 1)Compare with control group,P<0.05; 2)Compare with model group,P<0.05.
圖2 三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠病理染色的影響
Fig.2 Effect of Panax notoginseng granule on pathological staining in diabetic model rats
1)與對(duì)照組比較P<0.05; 2)與模型組比較P<0.05.
DN是患者發(fā)生終末期腎病的最主要原因,DN由糖尿病進(jìn)展而來,糖尿病可以影響骨骼、肌肉和肌腱等軟組織的愈合[14],糖尿病及其并發(fā)癥已成為威脅人類健康的常見病[15],DN病人大多通過透析來緩解病情,這對(duì)病人的身心健康造成很大的影響,目前對(duì)于DN的治療仍處在不斷探索之中[16].中醫(yī)學(xué)在 DN 治療方面有著悠久的歷史,DN屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”、“水腫”等范疇,其病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí),主要以氣陰兩虛為本,瘀血、濕濁或燥熱為標(biāo).中藥三七主治咯血、吐血、外傷出血等病癥,具有活血化瘀的功效,針對(duì)瘀血為主的糖尿病的發(fā)病機(jī)理.現(xiàn)代藥理學(xué)表明,三七的主要成分包括皂苷、三七素、揮發(fā)油、氨基酸、甾醇、糖類等,其中包含人參皂苷Rb1、三七皂苷R1和三七皂苷Fc等在內(nèi)的三七總皂苷為其主要藥理活性成分[10].臨床研究表明三七注射液可改善DN患者血液的高凝狀態(tài),發(fā)揮有益治療作用[17].課題組前期通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病環(huán)境下,三七皂苷R1可以通過上調(diào)α3β1整合素的表達(dá)而起到緩解糖尿病足細(xì)胞黏附的作用[13],而且三七皂苷Fc可明顯降低糖尿病db/db小鼠24 h尿白蛋白的排泄量[18].三七皂苷R1可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路來緩解DN大鼠足細(xì)胞的損傷[19].臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,銀可絡(luò)聯(lián)合三七顆粒和黃芪顆粒可以明顯改善DN的病情[11].然而,目前鮮有關(guān)于三七顆粒治療DN機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道,因此本研究通過觀察三七顆粒治療DN的情況,探討其對(duì)腎臟的保護(hù)作用機(jī)制.
1)與對(duì)照組比較,P<0.05; 2)與模型組比較,P<0.05.
Fig.4 Effect of Panax notoginseng granule on desmin, nephrin and α-SMA protein expression of renal podocyte EMT molecules in diabetic model rats
本實(shí)驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病大鼠模型,該方法具有簡(jiǎn)單易行、成模率較高的特點(diǎn)[20].糖尿病大鼠模型建立成功后,大鼠會(huì)慢慢出現(xiàn)蛋白尿升高的癥狀,后期發(fā)展至DN模型,因此本研究利用1型糖尿病模型大鼠探討三七顆粒對(duì)DN的治療作用.三七顆粒干預(yù)后可以輕微增加糖尿病模型大鼠的體質(zhì)量,但對(duì)血糖的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明三七顆粒減輕 DN足細(xì)胞損傷的作用可能與降低血糖無關(guān).為了進(jìn)一步探討三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化的影響,本研究對(duì)大鼠腎臟標(biāo)本進(jìn)行了HE染色和PAS染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七顆粒能明顯改善糖尿病模型大鼠系膜基質(zhì)增生的程度,表明三七顆粒能夠起到保護(hù)糖尿病模型大鼠腎臟的作用.足細(xì)胞是腎臟腎小囊臟層上皮細(xì)胞,它附著于腎小球基底膜的外側(cè),是構(gòu)成腎小球?yàn)V過膜的最后一道屏障,足細(xì)胞損傷是DN進(jìn)展的關(guān)鍵[21].研究表明足細(xì)胞損傷可引起蛋白尿和腎小球硬化,促進(jìn)DN進(jìn)展,最終導(dǎo)致腎功能衰竭[21].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三七顆粒能明顯改善糖尿病模型大鼠的足細(xì)胞足突融合程度,表明三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠腎臟足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷具有防護(hù)作用,進(jìn)而具有腎臟保護(hù)作用.此外,與模型組比較,三七顆粒組大鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐的值顯著降低,表明三七顆??赡芡ㄟ^降低糖尿病模型大鼠尿微量白蛋白/尿肌酐的值,降低蛋白尿,從而保護(hù)腎臟.
上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變是一種上皮細(xì)胞失去其特征并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征嚴(yán)格調(diào)控的過程,上皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞以應(yīng)對(duì)有害刺激,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化可引起糖尿病腎病足細(xì)胞損傷,在發(fā)生EMT過程中,足細(xì)胞中相關(guān)蛋白nephrin蛋白表達(dá)下降,desmin蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)上升[8, 22].足細(xì)胞EMT廣泛參與糖尿病腎病的早期階段,導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[23].Desmin蛋白是細(xì)胞骨架中間絲蛋白的一種,正常情況下腎小球系膜細(xì)胞有少量表達(dá),而足細(xì)胞無明顯表達(dá).當(dāng)足細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí), desmin蛋白可在足細(xì)胞中大量表達(dá)[24-25].Nephrin蛋白為足細(xì)胞裂孔膜蛋白組分,與腎小球?yàn)V過屏障功能密切相關(guān),研究表明nephrin蛋白表達(dá)異常是導(dǎo)致腎臟蛋白尿形成的主要原因,當(dāng)足細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí), nephrin蛋白在足細(xì)胞中表達(dá)下降[26].α-SMA蛋白作為足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志性蛋白,在糖尿病早期發(fā)生轉(zhuǎn)分化時(shí)α-SMA蛋白的表達(dá)下降,參與足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[27].本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了三七顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠足細(xì)胞desmin蛋白、nephrin蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠desmin蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá)上升,nephrin蛋白的表達(dá)下降,說明足細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化.三七顆粒組大鼠的desmin蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組,nephrin蛋白表達(dá)則明顯升高,說明三七顆??上抡{(diào)糖尿病模型大鼠腎臟組織desmin蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá),上調(diào)nephrin蛋白的表達(dá),改善足細(xì)胞EMT,這可能是其降低尿蛋白的分子機(jī)制之一.
綜上所述,三七顆粒能明顯改善糖尿病模型大鼠腎臟系膜基質(zhì)增生的程度,緩解腎臟足細(xì)胞足突融合的程度,具有腎臟保護(hù)作用.三七顆粒可改善糖尿病模型大鼠腎臟組織desmin蛋白、nephrin蛋白和α-SMA蛋白的表達(dá),改善足細(xì)胞損傷的程度,從而降低微量尿蛋白,延緩DN進(jìn)展.然而,本實(shí)驗(yàn)并沒有對(duì)三七顆粒與腎臟足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的上游機(jī)制之間的關(guān)系進(jìn)行研究,此亦為今后本課題組的研究方向,本課題組將繼續(xù)致力于三七對(duì)改善腎臟足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化損傷的分子機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路的研究,以期為臨床防治DN提供新的思路和方法.