王佐乾 楊小林 呂亮 袁斌 常向前 張舒

摘要：水稻稻曲病（Rice false smut，RFS）發(fā)生情況日趨嚴(yán)重，已經(jīng)上升為水稻主要病害之一。目前對(duì)稻曲病的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但對(duì)其病菌侵染方式和侵染機(jī)理的了解還有局限性。通過激光共聚焦和透射電鏡等方法已經(jīng)基本明確了稻曲病菌在穎花內(nèi)的侵染過程，然而稻曲病是否具有系統(tǒng)侵染、種子帶菌以及幼苗根部侵染對(duì)病害發(fā)生的影響程度仍有待明確。對(duì)稻曲病菌研究中存在的亟待解決的問題進(jìn)行了探討分析，同時(shí)也對(duì)稻曲病主要的防控手段和病原監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)。

關(guān)鍵詞：稻曲?。≧ice false smut，RFS）;侵染方式;侵染機(jī)制;活體寄生

中圖分類號(hào)：S432.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）09-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.001? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Rice false smut has become one of the most severe rice disease in China. At present， some progress has been made in the study of rice false smut. There are still some puzzles about infection site and infection mechanism in Villosiclava virens. Laser confocal microscopy and transmission electron microscopy （TEM） have helped to provide the specific description of infection process of rice false smut in spikelet. However， there were no molecular evidence about the contribution of systemic infection， seedling and seed infection in life cycle. The problems existing in the research of rice false smut were discussed and analyzed. At the same time， the main methods of prevention and control of rice false smut and the methods of pathogen surveillance were summarized.

Key words： rice false smut; infection site; infection mechanism; biotrophic infection

水稻稻曲病（Rice false smut，RFS）是由子囊菌門稻曲病菌（Villosiclava virens）引起的[1]，其無性世代為Ustilaginoidea virens。近年來稻曲病流行情況日趨嚴(yán)重，與稻瘟病、紋枯病并稱水稻新三大病害，據(jù)統(tǒng)計(jì)中國(guó)有1/3的水稻產(chǎn)區(qū)都受到稻曲病的危害[2]。

稻曲病菌在破口前侵染水稻穗部，而后通過吸收水稻穎殼內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)快速生長(zhǎng)最終膨大形成稻曲球，成熟的稻曲球由內(nèi)部質(zhì)密的菌絲和外部覆蓋大量墨綠色厚垣孢子組成。特定條件下，稻曲球上可形成菌核。據(jù)統(tǒng)計(jì)在溫帶和亞熱帶地區(qū)攜帶菌核的稻曲球比例大約在2.1%～15.0%，菌核形成大都在10月至11月初[3]。厚垣孢子在田間能夠存活超過4個(gè)月，而菌核則能夠存活時(shí)間更久，成熟的菌核需要2～5月的休眠期才能分化形成子實(shí)體[3]，子實(shí)體成熟后釋放子囊孢子，厚垣孢子及子囊孢子都能夠成為第二年的初侵染源。此外，稻曲球中富含稻曲菌素（ustiloxins）和稻核黑粉菌素（ustilaginoidins）兩類真菌毒素[4，5]。稻曲病的流行發(fā)生不僅會(huì)對(duì)稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，而且其產(chǎn)生的稻曲病菌毒素對(duì)人和生畜都有毒性。

化學(xué)防治是稻曲病防控的主要手段。研究表明穗苞破口前4～15 d是藥劑防治的主要時(shí)期，其中前4～7 d防治效果最佳[6]。播種前種子處理也可以有效控制稻曲病。有報(bào)道不同的水稻品種對(duì)稻曲病的抗感水平存在差異[7，8];Han等[9]通過RNA-Seq比較了抗病品種IR28和感病品種LVP9在病菌侵染初期基因表達(dá)動(dòng)態(tài)的差異。然而目前仍然沒有主效抗病基因被鑒定，數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTLs）的報(bào)道也比較少[10，11]。稻曲病抗病機(jī)理研究仍處于起步階段，抗病種質(zhì)資源仍然缺乏。

近年來稻曲病發(fā)病情況日趨嚴(yán)重，研究熱度也在增加。但由于稻曲病菌生物學(xué)性狀特殊，導(dǎo)致研究存在一定的困難，所以進(jìn)展也相對(duì)較緩慢。本文從稻曲病病害侵染規(guī)律角度對(duì)稻曲病相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)和展望。

1? 稻曲病病源種群鑒定與監(jiān)測(cè)

田間稻曲病菌種群的監(jiān)測(cè)有利于病害發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)。有學(xué)者通過基因組DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)稻曲病菌種群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)群體分布與地理區(qū)域之間關(guān)系顯著， 推測(cè)其傳播流行具有區(qū)域性[12]。Wang等[13]對(duì)來自湖北省的153個(gè)菌株分析，證實(shí)了地區(qū)對(duì)種群的影響多于水稻品種的影響。以上種群分布的研究結(jié)果為稻曲病區(qū)域防控提供了理論基礎(chǔ)。菌株分離有兩種主要方法，分別是厚垣孢子懸液法和組織塊分離法[14]。采用厚垣孢子分離方法，鮮黃色稻曲球平均分離成功率超過90%，墨綠色的厚垣孢子則無法成功分離[15]。此時(shí)的厚垣孢子已經(jīng)進(jìn)入休眠狀態(tài)，日常狀態(tài)下不易萌發(fā)，所以對(duì)于厚垣孢子已進(jìn)入休眠或者稻曲球保存時(shí)間較久的情況，火焰灼燒組織分離法更有效。經(jīng)過驗(yàn)證使用75%乙醇浸潤(rùn)后再用火焰灼燒，最后使用升汞消毒40 s分離效果最好[14]。雖然稻曲病菌是活體營(yíng)養(yǎng)型，但其也能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，屬非專性寄生。在以蔗糖為糖源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，并且蔗糖含量為2%～3%最佳。缺乏氮素的條件下不能生長(zhǎng)，氮、鉀、鋅缺乏則生長(zhǎng)情況較差。放置在黑暗條件下生長(zhǎng)狀況較好，菌絲生長(zhǎng)溫度為10～30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃[16]。

除了使用傳統(tǒng)的分離鑒定方法對(duì)菌源進(jìn)行監(jiān)測(cè)外，新型的分子生物學(xué)手段具有靈敏度高、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)。Zhou等[11]通過比較多個(gè)不同菌株之間的ITS1、ITS2和5.8s rRNA序列設(shè)計(jì)了能夠檢測(cè)稻曲病菌的特異引物。Chen等[17]利用稻曲病菌5.8S核糖體DNA設(shè)計(jì)的特異引物檢測(cè)了24個(gè)水稻樣本，其中9個(gè)樣品呈陽性，污染率達(dá)37.5%。為了檢測(cè)土壤中微量的稻曲病菌樣本，有學(xué)者根據(jù)核糖體DNA開發(fā)基于Real-time PCR技術(shù)的特異引物。通過檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)Real-time PCR檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)PCR和巢氏PCR高100倍以上[18]。但是基于PCR檢測(cè)方法均需要相關(guān)試驗(yàn)設(shè)備，操作步驟相對(duì)復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。Yang等[19]開發(fā)了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的快速檢測(cè)技術(shù)，這種方法具有反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)。對(duì)于田間種子檢測(cè)只需要用無菌水浸透種子，將浸出液體取10 μL加入到含有反應(yīng)試劑的離心管中，將離心管放置到65 ℃恒溫水浴鍋1 h，80 ℃加熱10 min即可終止反應(yīng)。此時(shí)即可通過HNB或者SYBR green I染料的顏色變化觀察反應(yīng)結(jié)果。這種方法為田間實(shí)地監(jiān)測(cè)提供了便利，降低了病原菌檢測(cè)的成本。

對(duì)于病原菌致病力的測(cè)定，因?yàn)榍秩疚稽c(diǎn)和侵染方式的特殊性，稻曲病采用水稻穗部注射的方法接種。在20世紀(jì)接種技術(shù)研究的早期，外國(guó)學(xué)者最先采用的方法是厚垣孢子噴霧接種。杜毅等[20]首次報(bào)道使用分生孢子注射接種水稻穗苞的方法，經(jīng)過不斷改進(jìn)該接種方法已經(jīng)可以達(dá)到穗發(fā)病率100%。抽穗破口前6～9 d，16：00～18：00時(shí)段，注射由PS培養(yǎng)基配制的分生孢子菌絲混合液，分生孢子濃度達(dá)到108效果最佳[21，22]。

2? 稻曲病菌的侵染方式

目前對(duì)稻曲病菌的侵染方式有兩種主要觀點(diǎn)。因?yàn)榈厩氩堪l(fā)病是惟一可見病征，并且人工接種時(shí)穗部注射接種的方式發(fā)病率明顯高于根部接種，所以主流觀點(diǎn)傾向于認(rèn)為稻曲病菌子囊孢子和厚垣孢子由上部隨水流進(jìn)入孕穗期水稻穎殼內(nèi)部完成侵染。Ashizawa等[23]使用GFP熒光菌株對(duì)侵染位點(diǎn)進(jìn)行觀察，提出病原菌是從潁殼頂端外稃和內(nèi)稃之間的縫隙進(jìn)入。Tang等[24]認(rèn)為菌絲進(jìn)入潁殼內(nèi)后首先侵染上部的花絲、花藥和柱頭，然后菌絲將雄蕊和雌蕊完全覆蓋直至潁殼內(nèi)充滿了菌絲。Song等[25]使用激光共聚焦對(duì)綠色熒光標(biāo)記菌株在潁殼內(nèi)擴(kuò)展各個(gè)時(shí)期做了觀察并進(jìn)行了詳細(xì)的描述。

稻曲病菌菌源空氣傳播的可能性較大。伏榮桃等[26]對(duì)不同氣象條件下稻曲病菌孢子釋放量進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)高溫高濕的氣候條件利于孢子釋放，夏季天氣炎熱陰雨較多年份發(fā)病率也相應(yīng)更高，推測(cè)空氣中懸浮的孢子量與發(fā)病率直接相關(guān)。俞咪娜等[27]對(duì)來自同一穗不同稻曲球，同一個(gè)稻曲球的不同部位分別進(jìn)行了分離，意外的是來自同一個(gè)稻曲球的菌株致病力也存在分化現(xiàn)象。經(jīng)過REP-PCR分子指紋圖譜（Repetitive DNA PCR-based genomic fingerprinting）遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)它們被劃分為不同的群體，由此推測(cè)一個(gè)稻曲球也可能混合不同來源菌株，穗部有可能同時(shí)接觸不同的初侵染菌株。以上結(jié)果說明稻曲病通過空氣傳播，側(cè)面說明穗部局部侵染的可能性較大。

另外一種觀點(diǎn)認(rèn)為稻曲病菌由水稻根部侵入，自下而上完成系統(tǒng)性侵染。張舒等[28]發(fā)現(xiàn)田間水稻套袋以后仍然可以發(fā)病，并且室內(nèi)試驗(yàn)中只在種子和幼苗根部接種的植株后期均可以發(fā)病。劉見平等[29]研究發(fā)現(xiàn)土壤和種子消毒的處理發(fā)病率顯著降低，說明種子帶菌和土壤中越冬的病菌為主要初侵染源。陳永堅(jiān)等[30]研究也發(fā)現(xiàn)帶有厚垣孢子的種子當(dāng)年發(fā)病率更高。呂博等[31]使用厚垣孢子分別在水稻芽期和三葉期進(jìn)行接種，此后水稻各個(gè)時(shí)期莖葉和穗部使用特異PCR檢測(cè)均有陽性。鄭大偉等[32]使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)苗期侵染進(jìn)行觀察，稻曲病菌能夠在細(xì)胞間隙內(nèi)擴(kuò)展。以上結(jié)果表明幼苗根部系統(tǒng)侵染存在可能，但目前無論是穗部局部侵染還是從根部系統(tǒng)性侵染都沒確鑿的證據(jù)，是單一侵染還是兩種侵染方式并存仍有待明確。

3? 稻曲病菌的侵染機(jī)制

稻曲病是局部侵染還是系統(tǒng)侵染仍然沒有確鑿的證據(jù)，但水稻穗部穎花是主要侵染位點(diǎn)已經(jīng)明確，所以穎花內(nèi)的侵染模式也是稻曲病研究的重點(diǎn)。早期學(xué)者曾認(rèn)為稻曲病菌只侵染已經(jīng)受精的穎殼[33];后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然激活了灌漿相關(guān)基因的表達(dá)，但是被侵染的潁殼不能完成灌漿并形成子粒，而且子房受精的穎花內(nèi)也無法形成稻曲球[34]。Tang等[35]將稻曲球解剖后顯微觀察發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部包裹的子房還是鮮活的。Song等[25]對(duì)花柱透射電鏡照片，發(fā)現(xiàn)菌絲侵入到花柱表皮細(xì)胞和柱頭細(xì)胞的縫隙當(dāng)中，并且擴(kuò)展到細(xì)胞間質(zhì)，但沒有穿透寄主細(xì)胞?；ǚ鄣某墒焓艿搅艘种?，模擬了子房受精，病菌挾持了灌漿基因，為菌絲的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。

稻曲病菌是比較典型的活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌，但與稻瘟病等其他菌株不同，沒有明顯的壞死斑出現(xiàn)，為了探究它如何克服寄主免疫防衛(wèi)反應(yīng)，Yin等[36]分析了bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因，數(shù)據(jù)表明28個(gè)基因中有17個(gè)在侵染階段表達(dá)上調(diào)，說明基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化劇烈。對(duì)早期侵染階段的轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)分泌蛋白、次級(jí)代謝以及病原寄主互作相關(guān)基因高度富集[37]。Fang等[38]利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)119個(gè)假定效應(yīng)蛋白進(jìn)行篩選，其中有13個(gè)能夠引起壞死斑。通過酵母驗(yàn)證了其中11個(gè)具有分泌活性，并利用水稻原生質(zhì)體確定了其致死活性。Zhang等[37]也對(duì)基因組中具有分泌活性的假定效應(yīng)蛋白進(jìn)行了分析，并且利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)鑒定了18個(gè)能夠抑制壞死的效應(yīng)因子。能夠抑制壞死的效應(yīng)因子在稻曲病侵染過程中的作用無疑是非常重要的。但是相比稻瘟病、小麥白粉病和大豆疫霉在病原植物互作方面深入系統(tǒng)的研究，稻曲病菌目前還沒有病原植物直接互作的分子證據(jù)，也沒有找到與效應(yīng)蛋白互作的抗性蛋白和代謝通路。

除對(duì)效應(yīng)蛋白探索分析外，功能基因組研究是挖掘致病關(guān)鍵基因的高效方法。目前稻曲病菌基因組分析已經(jīng)取得初步進(jìn)展。Zhang等[37]使用Illumina和454平臺(tái)對(duì)UV-8b菌株進(jìn)行了深度測(cè)序并成功拼接，基因組大小為39.4 Mb;預(yù)測(cè)得到8 426個(gè)基因;與來自10個(gè)子囊真菌和一個(gè)擔(dān)子菌基因組中的保守基因系統(tǒng)發(fā)育，分析發(fā)現(xiàn)稻曲病菌與兩個(gè)昆蟲病原真菌綠僵菌（Metarhizium spp）距離更近，甚至比侵染模式相似的麥角菌（Claviceps purpurea）更具親緣性[17]。在此基礎(chǔ)上稻曲病菌功能基因組的研究正在展開。Zheng等[39]首次報(bào)道對(duì)UvHog1基因成功敲除，發(fā)現(xiàn)敲除轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出菌絲、分生孢子的生長(zhǎng)缺陷，并且對(duì)SDS、剛果紅和高滲環(huán)境敏感。Lv等[40]通過T-DNA插入體庫(kù)的方法篩選到與菌絲生長(zhǎng)、分生孢子形成、非生物脅迫以及致病相關(guān)蛋白UvPro1并且通過敲除對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。Liang等[41]首次報(bào)道在稻曲病菌中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行敲除，效率比傳統(tǒng)敲除體系高200倍。

4? 問題與展望

由于氣候變化和栽培方式的改變，稻曲病流行情況日趨嚴(yán)重[42]。目前人類對(duì)稻曲病的了解仍然有限，以下方面仍然需要加強(qiáng)研究。

1）確定稻曲病初侵染來源及其侵染位點(diǎn)。利用攜帶分子標(biāo)記的菌株接種對(duì)根部或苗期侵染發(fā)展動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如何避免侵染過程中分子標(biāo)記丟失，并且排除植物表面粘附孢子帶來的干擾是技術(shù)難點(diǎn)。

2）稻曲病菌活體營(yíng)養(yǎng)機(jī)制尚需探究。從技術(shù)角度來說，在稻瘟病、白粉病和大豆疫霉中，效應(yīng)蛋白與寄主互作的研究方法已經(jīng)非常成熟;然而稻曲病菌與寄主互作模式可能存在獨(dú)特性，并且對(duì)水稻花器官組織侵染位點(diǎn)染色顯微觀察也存在困難。

3）目前通過圖位克隆的方法仍然沒有發(fā)現(xiàn)稻曲病的主效抗病基因，推測(cè)其抗病主要來源于數(shù)量性狀位點(diǎn)，而水稻穗部物理性狀差異對(duì)稻曲病致病力的影響也有待研究。

4）由于稻曲病侵染隱蔽、發(fā)病時(shí)段在水稻生產(chǎn)后期，所以對(duì)病害發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)開發(fā)非常急迫。在侵染前期使用LAMP等快速檢測(cè)方法評(píng)估菌源數(shù)量，采取對(duì)應(yīng)的控制手段可以有效減少稻米生產(chǎn)損失。

5）稻曲球表面菌素會(huì)危害人畜健康安全，其上的厚垣孢子和子囊孢子都可以成為次年的初侵染源。但迄今為止，關(guān)于稻曲球形成機(jī)制相關(guān)研究較少，稻曲球發(fā)育相關(guān)基因及代謝通路的研究未來能夠幫助人類找到減少其形成的方法。

總的來說，稻曲病在水稻生長(zhǎng)中的危害日趨嚴(yán)重，然而其侵染方式和侵染機(jī)制仍不明確，水稻抗病基因發(fā)掘和抗性品種的開發(fā)仍在進(jìn)行。加強(qiáng)對(duì)稻曲病侵染規(guī)律和致病機(jī)理的研究，有利于在生產(chǎn)中對(duì)稻曲病進(jìn)行全面防控。

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收稿日期：2018-12-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0200807）;湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目（2017ABA146）;湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016-620-000-001-017）

作者簡(jiǎn)介：王佐乾（1988-），男，山東青島人，助理研究員，博士，主要從事水稻病害研究，（電話）18971622069（電子信箱）wangzuoqian@sina.com;通信作者，張? 舒，研究員，（電子信箱）ricezs6410@163.com。