兩階段溶氧控制及FeSO4添加對(duì)谷氨酸棒桿菌合成4-羥基異亮氨酸的影響

孟靜，蘆楠，朱福周，董解榮，王子申，陳寧，張成林, 2 *

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(菱花集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)寧，272073)

4-羥基異亮氨酸是L-異亮氨酸羥化物，具有血糖水平依賴的促進(jìn)胰島素分泌的特性，同時(shí)還有保護(hù)肝功能、促進(jìn)脂肪代謝等功能，對(duì)糖尿病、高血脂、肥胖等疾病具有良好的預(yù)防和治療效果，應(yīng)用前景廣闊[1-6]。目前4-羥基異亮氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用胡蘆巴種子提取法，但該方法存在原材料需求量大、分離純化困難、提取率低(0.091%～0.6%)、成本高等不足[7]。而化學(xué)法反應(yīng)條件苛刻、步驟多、分離困難、收率低(21%～31%)而且容易引起環(huán)境污染，因此仍停留在研究階段[8-14]。KODERA等首次在蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) 中發(fā)現(xiàn)能夠以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為底物、特異性催化生成4-羥基異亮氨酸的異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase，IDO，由ido基因編碼)[9](圖1)。

圖1 異亮氨酸羥化酶催化生成4-羥異亮氨酸的反應(yīng)示意圖[8]
Fig.1 Diagram of reaction for 4-hydroxyisoleucine synthesis catalized by IDO

溶氧是微生物發(fā)酵過(guò)程中的重要環(huán)境因素之一，在菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和維持細(xì)胞的代謝中起著重要的作用[17-20]。溶氧均對(duì)上述代謝途徑有一定影響。此外，F(xiàn)e2+容易被氧化為Fe3+，在搖瓶發(fā)酵或者酶法合成4-羥基異亮氨酸時(shí)，通常添加還原性物質(zhì)(如Vc)防止其氧化[21-22]，然而在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中不易操作，故可通過(guò)控制溶氧或補(bǔ)充Fe2+來(lái)保持IDO活性。本文針對(duì)上述問(wèn)題，在明晰了4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中溶氧水平變化規(guī)律的基礎(chǔ)上優(yōu)化了溶氧控制水平和Fe2+的添加濃度，從而實(shí)現(xiàn)了4-羥基異亮氨酸的高效合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumHIL18，由本實(shí)驗(yàn)室保藏[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 25，酵母粉 5，(NH4)2SO45，KH2PO4·3H2O 2，MnSO4·7H2O 0.06，玉米漿 40 mL，pH 7.0～7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，(NH4)2SO43，KH2PO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·7H2O 0.015，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.017，VB10.001，谷氨酸 3，酵母粉 0.5，玉米漿 34 mL，pH 7.0～7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BIOTECH-5JG 5L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Thermo U3000高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn)

將活化后的C.glutamicumHIL18培養(yǎng)物以1%的接種量接種至含30 mL種子培養(yǎng)基，于32 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)10～12 h。將上述種子培養(yǎng)物以10%的接種量接種至含有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵過(guò)程中控制溫度34 ℃、用氨水控制pH=7.0，通過(guò)控制通風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)節(jié)溶氧水平，流加消泡劑消除泡沫?？疾?-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中溶氧水平的動(dòng)態(tài)變化時(shí)，通氣量為3.5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min。分階段溶氧控制策略如表1所示。

表1 4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中的兩階段溶氧控制策略Table 1 The two-stage DO control strategy during fermentation process of 4-hydroxyisoleucine

1.2.2 IDO酶活性測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中收集不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液，于4 ℃、8 000×g離心1 min后棄上清液。細(xì)胞重懸于10 mL Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)，然后利用超聲破碎儀破碎。將上述破碎物于4 ℃、13 000×g離心30 min后取上清，然后利用濾柱(PD-10 除鹽柱，英國(guó)GE Healthcare公司)過(guò)濾除鹽。取濾液100 μL加入900 μL含10 mmol/L α-酮戊二酸和L-異亮氨酸、5 mmol/L FeSO4和 10 mmol/L抗壞血酸的Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)，反應(yīng)30 min后利用高效液相色譜儀測(cè)定4-羥基異亮氨酸濃度[14]，以每毫克總蛋白每分鐘催化生成的4-羥基異亮氨酸[nmol/(min·mg蛋白)]表示IDO的比活力。

1.2.3 氨基酸、葡萄糖及生物量檢測(cè)

發(fā)酵過(guò)程中收集不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液1 mL，于4 ℃、 8 000×g離心5 min后取上清液。經(jīng)2, 4-二硝基氟苯衍生后利用高效液相色譜儀測(cè)定4-羥基異亮氨酸、L-異亮氨酸(Ile)、L-丙氨酸(Ala)、L-天冬氨酸(Asp)、L-亮氨酸(Leu)、L-纈氨酸(Val)和L-賴氨酸(Lys)，質(zhì)量濃度。檢測(cè)條件為：ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱(美國(guó)Agilent公司)，乙腈(體積分?jǐn)?shù)50%)/醋酸銨(50 mmol/L)二元梯度洗脫。采用SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)多功能谷氨酸-葡萄糖分析儀測(cè)定殘?zhí)橇?。發(fā)酵液經(jīng)離心后，用生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，然后用適量生理鹽水重懸。利用分光光度計(jì)測(cè)定其發(fā)酵液OD600，根據(jù)公式(1)計(jì)算菌體生物量：

細(xì)胞干重/(g·L-1)=0.242×OD600-0.016

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 溶氧水平對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響

4-羥基異亮氨酸的合成需要L-異亮氨酸和α-酮戊二酸，溶氧對(duì)這兩種前體物均有較大影響[23-24]，因此溶氧水平的控制對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵具有至關(guān)重要的作用?？疾炝巳苎跛綄?duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2和表2所示。

在不同溶氧水平條件下，菌株C.glutamicumHIL18的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸趨勢(shì)一致：發(fā)酵初期(0～20 h)生長(zhǎng)速率較快，20 h后逐漸下降，但4-羥基異亮氨酸的合成速率和產(chǎn)量逐漸提升。當(dāng)溶氧水平為20%時(shí)，生物量、4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率最高，分別為18.3 g/L、34.1 g/L和15.0%。當(dāng)溶氧水平為30%時(shí)，發(fā)酵初期的生物量高于其余溶氧水平，但隨后生長(zhǎng)速率迅速下降，其原因可能是盡管溶氧水平的升高提高了生長(zhǎng)速率，但使得菌體細(xì)胞過(guò)早衰老，發(fā)酵終止時(shí)其生物量、4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量分別為13.5 g/L和24.5 g/L，高于溶氧水平為10%；但其轉(zhuǎn)化率低于后者，其原因可能是由于葡萄糖的消耗除用于合成4-羥 基異亮氨酸外，更多用于菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和呼吸作用。溶氧水平為20%時(shí)，主要副產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸和L-異亮氨酸均高于溶氧水平為10%；而溶氧水平為30%時(shí)，上述副產(chǎn)物最低。由此推測(cè)，適當(dāng)?shù)娜苎跛?20%)提高了TCA循環(huán)代謝流，從而為4-羥基異亮氨酸的合成提供更多的α-酮戊二酸；但當(dāng)溶氧水平過(guò)高(30%)時(shí)，TCA循環(huán)代謝流進(jìn)一步增強(qiáng)，使得L-異亮氨酸和α-酮戊二酸代謝不平衡，不利于4-羥基異亮氨酸的合成。

A-4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量及生物量；B-氨基酸質(zhì)量濃度圖2 溶氧水平對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of DO levels on 4-hydroxyisoleucine fermentation

表2 溶氧對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of DO levels on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.2 4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中溶氧水平的動(dòng)態(tài)變化

IDO屬于Fe2+和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，故催化4-羥基異亮氨酸合成時(shí)需要O2[9, 25]。由圖2-A可知，C.glutamicumHIL18的最高生長(zhǎng)速率和4-羥基異亮氨酸的最高合成速率分別于發(fā)酵初期和中期，可見(jiàn)4-羥基異亮氨酸的合成為非生長(zhǎng)依賴型。綜上，推測(cè)在發(fā)酵過(guò)程中C.glutamicumHIL18對(duì)溶氧的需求會(huì)有所變化。因此考察了4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中溶氧水平的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果如圖3所示。溶氧水平于0～10 h迅速下降，于10～20 h緩慢下降，該階段以菌體生長(zhǎng)為主，4-羥基異亮氨酸合成速率逐漸提高。溶氧于20～40 h再次快速下降，該階段菌體生長(zhǎng)速率顯著下降，但4-羥基異亮氨酸合成速率和產(chǎn)量迅速提升。40 h后溶氧水平趨于穩(wěn)定，菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，4-羥基異亮氨酸合成量持續(xù)增加，但其合成速率顯著降低，其原因可能是過(guò)低的溶氧難以滿足4-羥基異亮氨酸合成的需求。由此可見(jiàn)，發(fā)酵中期及后期時(shí)，C.glutamicumHIL18對(duì)氧需求量進(jìn)一步升高。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和菌體生物量分別達(dá)到15.7 g/L和15.4 g/L。

圖3 4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中溶氧水平動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamics of DO levels during 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.3 兩階段溶氧控制對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響

2.3.1 兩階段溶氧水平優(yōu)化

由圖3可知，4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中對(duì)氧的需求不同，即發(fā)酵中期和后期(20～64 h)較發(fā)酵初期(0～20 h)需氧量高。因此，控制發(fā)酵過(guò)程中各階段的溶氧水平，可滿足C.glutamicumHIL18對(duì)氧的需求，并有望進(jìn)一步提高4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量。結(jié)合結(jié)果2.1和2.2，提出4種分階段溶氧控制策略(表1)，并考察其對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響。結(jié)果如圖4和表3所示。

控制策略Ⅲ時(shí)，于發(fā)酵中期和后期4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)酸速率高于其他策略，其終產(chǎn)量達(dá)到最高值38.7 g/L，其次依次為策略Ⅱ、Ⅰ和Ⅳ；然而控制策略Ⅳ條件下，生物量最高，為22.1 g/L，其次依次為策略Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ。此外，還可知溶氧控制策略Ⅲ條件下，葡萄糖消耗量(255.9 g/L)最大。由此可見(jiàn)，不同的溶氧控制策略導(dǎo)致菌體生物量和4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量差異較大。發(fā)酵前期溶氧控制在20%、后期控制在30%時(shí)效果最佳。這可能與細(xì)胞實(shí)際需氧量吻合，即發(fā)酵初始階段，細(xì)胞生長(zhǎng)所需溶氧相對(duì)少，4-羥基異亮

A-4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量; B-生長(zhǎng)曲線圖4 溶氧控制策略對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of DO control strategies on 4-hydroxyisoleucine fermentation

表3 溶氧控制策略對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of DO control strategies on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

發(fā)酵參數(shù)溶氧控制策略ⅠⅡⅢⅣ4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量/(g·L-1)34.836.138.730.5生物量/(g·L-1)18.018.520.222.1耗糖量/(g·L-1)230.5240.7255.9213.3轉(zhuǎn)化率/%15.115.015.114.3單位菌體產(chǎn)量/(g· g-1)1.92.01.91.4發(fā)酵強(qiáng)度/[g·(L·h)-1]0.50.60.60.5

氨酸合成代謝速率低，從而需要較低的氧氣供應(yīng)；發(fā)酵中期和后期4-羥基異亮氨酸合成速率增加，故氧氣需求量提高。

2.3.2 溶氧轉(zhuǎn)變時(shí)間對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響

分別于16、18、20、22和24 h提高溶氧水平至30%，考察其對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響。結(jié)果如表4所示。

表4 溶氧轉(zhuǎn)變時(shí)間對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of DO shift time on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

溶氧轉(zhuǎn)變時(shí)間為16、18和20 h時(shí)，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量依次升高， 20 h時(shí)其產(chǎn)量最高。溶氧轉(zhuǎn)變時(shí)間為22和24 h時(shí)，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量降低?？梢?jiàn)，20 h時(shí)提高溶氧至30%最有利于4-羥基異亮氨酸的合成。

2.4 FeSO4添加工藝優(yōu)化

2.4.1 FeSO4初始濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響

如前所述，IDO在催化4-羥基異亮氨酸合成過(guò)程需要Fe2+，研究表明Fe2+濃度對(duì)其活性影響顯著[9，25-26]。Fe2+在發(fā)酵過(guò)程中容易被O2氧化，不利于IDO催化L-異亮氨酸合成4-羥基異亮氨酸?？疾炝薋eSO4初始濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如表5所示。隨著FeSO4濃度的增加，4-羥基異亮氨酸的合成量提高，當(dāng)其濃度為65 μmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量達(dá)到41.5 g/L，表明該條件下有利于IDO活性的保持。當(dāng)FeSO4濃度高于65 μmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量不再提高。而FeSO4濃度對(duì)生物量無(wú)明顯影響。

表5 FeSO4初始濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 5 Effects of primary FeSO4 concentration on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

2.4.2 發(fā)酵過(guò)程中添加FeSO4對(duì)4-羥基異亮氨酸發(fā)酵的影響

由于在發(fā)酵20 h后溶氧水平提升，F(xiàn)e2+可能易被O2氧化為Fe3+，不利于IDO活性的保持。檢測(cè)了發(fā)酵過(guò)程中IDO的活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中添加FeSO4對(duì)IDO活性的影響Fig.5 Effects of FeSO4 addition during fermentation process on IDO activity

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，IDO活性持續(xù)提高，但24 h 時(shí)IDO的活性降低，隨后劇烈降低，由此推測(cè)發(fā)酵20 h后，隨著溶氧水平的提升，部分Fe2+被氧化，致使IDO活性下降，影響4-羥基異亮氨酸的合成。因此考察了20 h添加不同濃度FeSO4對(duì)4-羥基異亮氨酸的影響。結(jié)果如表6所示，F(xiàn)eSO4添加量為10 μmol/L 對(duì)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量無(wú)明顯影響；FeSO4添加量為30 μmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量為43.4 g/L， 提高5.6%；但其高于30 μmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量不再提高。檢測(cè)了該條件下IDO活性變化，結(jié)果如圖5所示，于20 h添加FeSO4后，IDO活性緩慢提升，40 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。綜上，F(xiàn)eSO4添加工藝優(yōu)化后，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量提高13.6%。

表6 發(fā)酵過(guò)程添加FeSO4對(duì)4-羥基異亮 氨酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 6 Effects of FeSO4 addition during fermentation process on parameters of 4-hydroxyisoleucine fermentation

3 結(jié)論

結(jié)合菌株C.glutamicumHIL18特性優(yōu)化了溶氧水平，20%的溶氧有利于4-羥基異亮氨酸的合成。根據(jù)C.glutamicumHIL18發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶氧需求的變化，提出兩階段溶氧控制工藝，0～20 h、20%溶氧，20～64 h、30%溶氧，在此條件下，4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量為38.7 g/L，提高11.2%。為避免Fe2+被氧化，在兩階段溶氧控制策略的基礎(chǔ)上采用兩階段FeSO4添加策略，初始濃度為65 mmol/L、20 h添加30 mmol/L， 4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量為43.4 g/L。采用優(yōu)化后的工藝使得4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量較優(yōu)化前提高27.3%。本文優(yōu)化了4-羥基異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程中的溶氧水平，但其機(jī)制尚不明確。今后工作擬從基因轉(zhuǎn)錄及代謝流等角度開(kāi)展溶氧水平影響C.glutamicumHIL18合成4-羥基異亮氨酸的機(jī)制研究，以期為進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵工藝提供依據(jù)。