鄭建勇 田慧 王正斌 龔靜

杏芎氯化鈉注射液由兩種主要成分銀杏葉提取物和磷酸川芎嗪組成, 臨床用于治療缺血性心腦血管疾病, 如腦供血不足、腦血栓的形成、腦栓塞、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心腦血管疾病, 其中主要原料為磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazine hosphate, TMPP), 化學(xué)名稱為 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪磷酸鹽一水合物, 為一種新型的鈣離子拮抗劑［1,2］, 有活血化瘀、抗血小板凝集、擴(kuò)張小動(dòng)脈、疏通微循環(huán)、促進(jìn)炎癥吸收等作用［3,4］, 臨床上主要用于腦梗死、缺血性腦血管病、冠心病、心絞痛、糖尿病并發(fā)癥等治療。本文通過(guò)對(duì)原料及制劑中磷酸川芎嗪中有關(guān)物質(zhì)的對(duì)比研究分析, 確定制劑中有關(guān)物質(zhì)的來(lái)源、結(jié)構(gòu)并進(jìn)行定量檢測(cè), 報(bào)告如下。

1 材料來(lái)源

1.1 試驗(yàn)方法 Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀；Agilent 6470 三重四極桿質(zhì)譜；雜質(zhì)1 對(duì)照品(Aldrich, CBR00478)；甲醇、醋酸均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 取磷酸川芎嗪原料(CX1705801), 加水溶解并稀釋制成0.5 mg/ml 的溶液, 作為供試品溶液；精密量取1 ml, 置200 ml量瓶中, 用水稀釋至刻度, 搖勻, 作為對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件 照高效液相色譜法試驗(yàn), 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(45∶55)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為295 nm。分別稱取磷酸川芎嗪對(duì)照品2 mg 與鄰苯二甲酸二甲酯對(duì)照品12 mg, 置同一100 ml 量瓶中, 加甲醇2 ml 溶解, 用水稀釋至刻度, 搖勻, 作為系統(tǒng)適用性溶液, 取20 μ1 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 理論板數(shù)按川芎嗪峰計(jì)算, ≥2000, 川芎嗪峰與雜質(zhì)Ⅰ峰的分離度應(yīng)＞4.0。精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各20 μl, 分別注入液相色譜儀, 記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3 倍。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果 供試品溶液的色譜圖中有三個(gè)有關(guān)物質(zhì)峰, 見(jiàn)圖1。峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5%。

圖1 磷酸川芎嗪中有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.4 物質(zhì)結(jié)構(gòu)探索 采用UHPLC-QTOF 質(zhì)譜和UHPLCQQQ質(zhì)譜, 對(duì)圖1中三個(gè)有關(guān)物質(zhì)峰(雜質(zhì)峰)進(jìn)行定性研究, 經(jīng)結(jié)構(gòu)推斷, 并結(jié)合文獻(xiàn), 雜質(zhì)1 為(3, 5, 6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇［化學(xué)物質(zhì)登記號(hào)(CAS No.)：75907-74-3］, 雜質(zhì)2 為2, 3, 5-三甲基吡嗪(CAS No.：14667-55-1), 雜質(zhì)3 為2-乙基-3, 5, 6-三甲基吡嗪(CAS No.：17398-16-2)。其中雜質(zhì)1、雜質(zhì)2 經(jīng)對(duì)照品確認(rèn), 雜質(zhì)3 為根據(jù)其精確分子量、二級(jí)質(zhì)譜及文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)。見(jiàn)圖2。根據(jù)ICH 規(guī)定, 原料中主成分每日最大攝入量≤2 g 時(shí), 雜質(zhì)報(bào)告限為0.050%。采用主成分自身對(duì)照法, 經(jīng)檢驗(yàn), 本品原料中雜質(zhì)1 相對(duì)含量為0.030%, 雜質(zhì)2 為0.030%, 雜質(zhì)3 為0.010%, 均小于ICH規(guī)定的報(bào)告限。

圖2 供試品溶液的色譜圖

3 杏芎氯化鈉制劑中磷酸川芎嗪有關(guān)物質(zhì)初探

參照原料方法, 以高效液相色譜法測(cè)定制劑中雜質(zhì)含量, 結(jié)果銀杏葉提取物對(duì)其測(cè)定干擾較大, 無(wú)法有效分離, 因此采用專屬性更強(qiáng)的液質(zhì)聯(lián)用方法。

采用液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行測(cè)定, 因質(zhì)譜測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)影響較大, 原料用空白基質(zhì)(不含磷酸川芎嗪)溶液配制成0.4 mg/ml 的溶液, 再用水稀釋為50 μg/ml 的溶液；注射液(磷酸川芎嗪處方量0.4 mg/ml 均采用該批號(hào)原料投料)用水稀釋為含磷酸川芎嗪50 μg/ml 的溶液, 比較二者峰面積。

結(jié)果表明, 雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3 峰面積基本一致?？梢?jiàn)該原料有關(guān)物質(zhì)在制劑生產(chǎn)過(guò)程未發(fā)生變化, 為了進(jìn)一步確定雜質(zhì)含量, 擬通過(guò)雜質(zhì)1 含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量的表征。

3.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液的制備：取雜質(zhì)1 對(duì)照品(Aldrich, CBR00478)適量, 精密稱定, 加空白基質(zhì)(不含磷酸川芎嗪)溶液制成含量為50、10、5、2、1 ng/ml 的系列溶液, 作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：直接進(jìn)樣測(cè)定。

3.2 色譜條件 色譜質(zhì)譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(45：55)為流動(dòng)相, 采用三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器, ESI 負(fù)離子模式下MRM, 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：153.1 →135.0, 153.1 →53.2。

測(cè)定法：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.1 μl, 注入液相色譜-質(zhì)譜儀, 測(cè)定。

3.3 試驗(yàn)結(jié)果 杏芎氯化鈉制劑中雜質(zhì)1 含量為0.007%, 遠(yuǎn)低于ICH 對(duì)制劑中雜質(zhì)報(bào)告限規(guī)定的0.100%, 安全風(fēng)險(xiǎn) 較低。