王光飛, 馬 艷**, 郭德杰, 羅 佳, 梁永紅, 仇美華

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生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防微生物抑制辣椒疫霉的作用*

王光飛1, 馬 艷1**, 郭德杰1, 羅 佳1, 梁永紅2, 仇美華2

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部長江下游平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210014; 2. 江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站 南京 210036)

生物質(zhì)炭可有效防控土傳病害, 篩選并鑒定出生物質(zhì)炭介導(dǎo)下的生防微生物, 可為研究生物質(zhì)炭防病機(jī)理和強(qiáng)化生物質(zhì)炭防病效果提供理論依據(jù)。本研究首先進(jìn)行秸稈生物質(zhì)炭防控辣椒疫病盆栽試驗(yàn), 利用定量PCR和平板計(jì)數(shù)明確生物質(zhì)炭在防控辣椒疫病時(shí)可富集的已知生防微生物, 再通過選擇性培養(yǎng)基初篩和定殖復(fù)篩篩選出生物質(zhì)炭可富集的潛在生防微生物菌株, 最后研究各菌株在土壤中對辣椒疫霉的抑制作用。結(jié)果表明, 秸稈生物質(zhì)炭使根際辣椒疫霉數(shù)量顯著降低95.1%、辣椒疫病發(fā)生率顯著降低91.1%, 并使具有生防功能的木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌數(shù)量顯著增加2.22倍、4.09倍、3.89倍、2.45倍、1.45倍和1.30倍。通過平板初篩得到可能被生物質(zhì)炭富集的22株潛在生防菌株。定殖復(fù)篩剔除部分假性生物質(zhì)炭介導(dǎo)菌株, 獲得可明確被生物質(zhì)炭富集的2株木霉菌、3株青霉菌、2株曲霉菌、3株芽孢桿菌、3株假單胞菌、3株鏈霉菌和2株鞘氨醇單胞菌。木霉菌(TR1和TR3)、青霉菌(PE1)、曲霉菌(AS1和AS2)、芽孢桿菌(BA1、BA2和BA3)、假單胞菌(PS1和PS3)、鏈霉菌(ST1、ST4和ST5)13個(gè)菌株可顯著削減土壤辣椒疫霉數(shù)量。其中, 所有木霉菌和曲霉菌菌株(TR1、TR3、AS1和AS2)及芽孢桿菌(BA1和BA2)、假單胞菌(PS1和PS3)和鏈霉菌(ST1)9個(gè)菌株與生物質(zhì)炭具有顯著的協(xié)同抑制辣椒疫霉效果。因此, 防控辣椒疫病時(shí), 木霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌是生物質(zhì)炭介導(dǎo)下的主要防病微生物。

生物質(zhì)炭; 生防真菌; 生防細(xì)菌; 辣椒疫霉

生物質(zhì)炭是由生物質(zhì)原料如木材、農(nóng)作物廢棄物、畜禽糞便或生活垃圾等在無氧或缺氧條件下高溫裂解產(chǎn)生的固體產(chǎn)物, 具有比表面積大、孔結(jié)構(gòu)豐富、吸附能力強(qiáng)的特點(diǎn), 并且富含有機(jī)碳、礦質(zhì)養(yǎng)分及多種官能團(tuán)等, 廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)、能源等領(lǐng)域[1]。作為一種新型的土壤改良劑, 生物質(zhì)炭在土壤中穩(wěn)定性高, 具有改善土壤理化性質(zhì)、提高水土保持能力和增加有機(jī)碳庫的良好作用[2-3]。另外, 生物質(zhì)炭對土壤微生物區(qū)系及土壤微生態(tài)環(huán)境有重要影響, 可直接或間接影響植物生長發(fā)育過程。多項(xiàng)研究表明生物質(zhì)炭能顯著提高微生物多樣性和活性, 并改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[2-4]。

近年研究顯示生物質(zhì)炭可有效防控蘆筍/番茄枯萎病、黃瓜/豆類猝倒病和煙草/番茄青枯病等土傳病害[5-9], 其防控機(jī)理在于改善土壤生物和理化性狀、抑制病原菌及誘導(dǎo)植物抗病性等[10-11]。本研究室以往研究顯示秸稈生物質(zhì)炭可有效防控辣椒疫霉引起的辣椒疫病, 防病機(jī)理與其改變土壤微生物區(qū)系密切相關(guān), 同時(shí)也初步顯示出了生物質(zhì)炭對潛在生防微生物的增殖作用[12]。多項(xiàng)研究已表明生物質(zhì)炭能顯著提高土壤中木霉、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等具有生防功能的微生物數(shù)量, 這可能是其防控土傳病害的重要機(jī)理[8,13-14]。

目前, 雖有一些研究從微生物區(qū)系方面探明生物質(zhì)炭防控土傳病害機(jī)理[6-8], 但至今少有生物質(zhì)炭防控土傳病害與其富集微生物關(guān)系的研究, 也鮮有生物質(zhì)炭介導(dǎo)防病微生物的篩選研究。鑒于此, 本文研究了生物質(zhì)炭防控辣椒疫病時(shí)可顯著富集的潛在生防微生物, 并對其進(jìn)行篩選和功能驗(yàn)證, 以明確和篩選出可被生物質(zhì)炭富集并能與生物質(zhì)炭協(xié)同抑制辣椒疫霉的生防微生物。本研究不僅為利用生物質(zhì)炭防控辣椒疫病等土傳病害提供理論依據(jù), 而且為強(qiáng)化生物質(zhì)炭防控土傳病害效果提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

生物質(zhì)炭由中國科學(xué)院南京土壤研究所謝祖彬研究員提供, 由玉米秸稈經(jīng)馬弗爐500 ℃厭氧裂解1 h所得, 粉碎過40目篩后備用。理化性狀: pH 9.82, 電導(dǎo)率6091.3 μS?cm-1, 有機(jī)質(zhì)含量359.4 g?kg-1, 全氮含量4.96 g?kg-1, 全磷含量3.17 g?kg-1, 全鉀含量37.16 g?kg-1, 有效磷含量2.22 g?kg-1, 速效鉀含量24.77 g?kg-1。

供試土壤為淮安設(shè)施耕作土。理化性狀: pH 7.20, 電導(dǎo)率706.5 μS?cm-1, 有機(jī)質(zhì)含量30.1 g?kg-1, 全氮含量3.21 g?kg-1, 全磷含量1.19 g?kg-1, 全鉀含量18.21 g?kg-1, 有效磷含量165.3 mg?kg-1, 速效鉀含量179.1 mg?kg-1。

供試?yán)苯芬呙咕杀緦?shí)驗(yàn)室分離所得。供試?yán)苯菲贩N為‘蘇椒五號’。

1.2 生物質(zhì)炭對辣椒根際有益微生物數(shù)量的影響

在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境研究所大棚進(jìn)行盆栽試驗(yàn), 自然光照, 溫度25~32 ℃。將制備好的辣椒疫霉游動(dòng)孢子液噴灑加入土壤中, 并拌勻, 使得每克干土辣椒疫霉數(shù)量為100個(gè)游動(dòng)孢子。再將試驗(yàn)土壤設(shè)兩個(gè)處理: 1)空白對照(CK), 生物質(zhì)炭施用量為0 g?kg-1。2)生物質(zhì)炭施用量為13.3 g?kg-1(BC), 生物質(zhì)炭加入土壤并拌勻。各處理土壤分裝到圓口盆缽中, 每盆550 g含水量為16%的鮮土。每個(gè)處理45盆, 每15盆為1個(gè)重復(fù)。每盆種植1株六葉期辣椒苗。土壤處理時(shí)和栽植期間均未施肥。栽植15 d后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù), 并采集各處理根際土樣測定有益微生物數(shù)量和辣椒疫霉數(shù)量。

測定的有益微生物包括木霉菌()、青霉菌()、曲霉菌()、芽孢桿菌()、假單胞菌()、鏈霉菌()和鞘氨醇單胞菌()。木霉菌、青霉菌和曲霉菌在馬丁氏培養(yǎng)基平板上菌落特征明顯, 采用梯度稀釋涂平板法測定木霉菌、青霉菌和曲霉菌數(shù)量。采用定量PCR測定土壤中的辣椒疫霉[15]、芽孢桿菌[16]、假單胞菌[16]、鏈霉菌[17]和鞘氨醇單胞菌[18]數(shù)量。土壤DNA提取所用試劑盒為MP公司生產(chǎn)的FastDNA SPIN Kit for Soil, 按照使用說明提取土壤DNA。芽孢桿菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌采用染料法定量PCR, 所用試劑盒為TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex Taq?, 按照使用說明進(jìn)行定量PCR, 辣椒疫霉、芽孢桿菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌的定量引物分別為CAPFW/CAPRV1[15]、BacF/1378R[16]、Psf/Psr[16]和Sphingo108f/Sphingo420r[18]。鏈霉菌采用探針法定量PCR, 所用試劑盒為TaKaRa 公司生產(chǎn)的Premix Ex Taq? (Probe qPCR), 定量引物為StrepF/ StrepR, 探針為Strep-Probe[17]。

1.3 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌菌株的篩選

1.3.1 平板初篩

將1.2中CK和BC處理的根際土樣進(jìn)行梯度稀釋后涂平板, 采用5種不同培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)。馬丁氏培養(yǎng)基可生長木霉、青霉和曲霉。V8培養(yǎng)基、King’s B培養(yǎng)基[19]、STR培養(yǎng)基[20]和Sphing培養(yǎng)基[21]分別為芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌的選擇性培養(yǎng)基。通過分析比較不同培養(yǎng)基下CK和BC處理間的目標(biāo)微生物菌落特征和數(shù)量, 初步篩選出BC處理中顯著多于CK處理的木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌菌株。

1.3.2 分子鑒定及平板拮抗辣椒疫霉效果

將1.3.1中篩選得到的菌株進(jìn)行基因組DNA提取, 所用試劑盒為OMEGA公司生產(chǎn)的Bacterial DNA Kit和Fungal DNA Kit, 按照使用說明提取DNA。真菌DNA采用ITS保守序列通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌DNA采用16S rRNA保守序列通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序, 將測定序列在GenBank中用Blast軟件與數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行同源性比較。

將新鮮辣椒疫霉菌餅置于PDA平板中央, 在其兩側(cè)25 mm處接種待測細(xì)菌菌株, 每個(gè)菌株重復(fù)3次, 28 ℃培養(yǎng)5 d后, 根據(jù)待測細(xì)菌菌落邊緣與辣椒疫霉菌落邊緣之間的距離判定拮抗能力。將辣椒疫霉菌餅置于PDA平板離邊15 mm處, 在另一側(cè)離邊15 mm處接種待測真菌菌株菌餅, 每個(gè)菌株重復(fù)3次, 28 ℃培養(yǎng) 5 d后, 根據(jù)待測真菌菌落對辣椒疫霉菌落重寄生長度判定拮抗能力。

1.3.3 定殖復(fù)篩

將1.3.1中初篩得到的真菌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng), 以獲得每個(gè)真菌菌株的新鮮菌絲, 離心生理鹽水懸浮再勻漿后備用。將初篩得到的細(xì)菌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng), 離心生理鹽水懸浮后備用。將試驗(yàn)土壤分為對照土壤和生物質(zhì)炭土壤, 生物質(zhì)炭用量分別為0 g?kg-1和13.3 g?kg-1, 將各初篩細(xì)菌和真菌菌株分別添加到對照土壤中和生物質(zhì)炭土壤中, 土壤中目標(biāo)真菌添加濃度均為新鮮菌絲10 g?kg-1, 目標(biāo)細(xì)菌的添加濃度均為107CFU?g-1。將含有目標(biāo)菌的對照土壤和生物質(zhì)炭土壤分別分裝到圓口盆缽中, 每盆550 g鮮土。每個(gè)處理3盆, 每盆為1個(gè)重復(fù)。每盆種植1株六葉期辣椒苗。同1.2條件下種植15 d后, 對根際目標(biāo)菌進(jìn)行計(jì)數(shù), 方法同1.2。在生物質(zhì)炭土壤辣椒根際中定殖數(shù)量顯著高于對照土壤的菌株則為生物質(zhì)炭介導(dǎo)的潛在生防菌。

1.4 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌削減辣椒疫霉數(shù)量能力的測定

將制備好的辣椒疫霉游動(dòng)孢子液噴灑加入土壤中, 并拌勻, 使得每克干土辣椒疫霉數(shù)量為500個(gè)游動(dòng)孢子。再分為對照土壤和生物質(zhì)炭土壤, 生物質(zhì)炭用量分別為0 g?kg-1和13.3 g?kg-1。將供試生防菌分別加入到對照土壤和生物質(zhì)炭土壤中。生防真菌的添加方式為將1.3.3中的新鮮菌絲按10 g?kg-1添加到土壤中。生防細(xì)菌的添加方式為將1.3.3中的菌液添加到土壤中, 添加濃度均為107CFU?g-1。將含有目標(biāo)菌的對照土壤中和生物質(zhì)炭土壤, 分別分裝到圓口盆缽中, 每盆550 g鮮土。每個(gè)處理3盆, 每盆為1個(gè)重復(fù)。同1.2條件下保濕培養(yǎng)15 d后, 對土壤辣椒疫霉數(shù)量進(jìn)行定量檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

測定數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016軟件作圖, 用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文中發(fā)病率和土壤微生物數(shù)量均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物質(zhì)炭對辣椒根際有益微生物數(shù)量的影響

由表1可知, 含等濃度辣椒疫霉的對照土壤(CK)和生物質(zhì)炭土壤(BC)在移栽辣椒15 d后, 辣椒疫霉病的病情指數(shù)分別為32.56%和2.91%, 辣椒疫霉數(shù)量分別為12.67′104copies?g-1(土)和0.62′104copies?g-1(土), 兩處理均存在顯著差異。根際有益微生物數(shù)量方面, BC處理木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌數(shù)量分別是CK處理的2.22倍、4.09倍、3.89倍、2.45倍、1.45倍和1.30倍, 且均達(dá)到顯著差異。與前人研究相符, 生物質(zhì)炭能有效降低土壤中病原菌數(shù)量和土傳病害發(fā)生率, 并且可增加土壤有益微生物數(shù)量, 生物質(zhì)炭對土壤有益微生物的增殖作用可能是其防控土傳病害主要機(jī)理之一。雖然本研究中生物質(zhì)炭對鏈霉菌數(shù)量影響較小, 但筆者以往研究顯示生物質(zhì)炭可顯著增加鏈霉菌數(shù)量[12]。

同行不同小寫字母表示對照和生物質(zhì)炭處理間達(dá)顯著差異(0.05)。In each row, means followed by different lowercase letters are significantly different at< 0.05.

2.2 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌的初篩及分子鑒定

通過分析比較CK處理和BC處理在馬丁氏平板上的木霉菌、青霉菌和曲霉菌數(shù)量及菌落特征, 初步篩選出BC處理中數(shù)量顯著多于CK處理的3株木霉菌菌株(TR1、TR2、TR3)、3株青霉菌菌株(PE1、PE2、PE3)和兩株曲霉菌菌株(AS1、AS2)。通過分析比較CK處理和BC處理在特定選擇性培養(yǎng)基平板上的芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌數(shù)量及菌落特征, 初步篩選出生物質(zhì)炭可富集的4株芽孢桿菌株(BA1、BA2、BA3、BA4)、3株假單胞菌菌株(PS1、PS2、PS3)、5株鏈霉菌菌株(ST1、ST2、ST3、ST4、ST5)和兩株鞘氨醇單胞菌菌株(SP1、SP2)。各菌株分子鑒定結(jié)果見表2。可見, 在馬丁氏平板上通過菌落形態(tài)辨別木霉菌、青霉菌和曲霉菌具有很高的準(zhǔn)確性。芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌選擇性培養(yǎng)基對目標(biāo)微生物的選擇性較高, 結(jié)合菌落形態(tài)特征也可準(zhǔn)確地篩選出特定屬微生物。

2.3 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌的復(fù)篩

對初篩生防菌進(jìn)行定殖復(fù)篩, 能在辣椒根際土壤中被生物質(zhì)炭所富集即為生物質(zhì)炭介導(dǎo)的防病微生物。生防真菌方面, 生物質(zhì)炭可顯著增加根際木霉菌TR1和TR3、青霉菌PE1和PE2及曲霉菌AS1和AS2的數(shù)量, 對青霉菌PE3數(shù)量也有較強(qiáng)的增加作用。TR1、TR3、PE2和AS2在平板上對辣椒疫霉菌具有強(qiáng)重寄生作用, 但PE1、PE3和AS1作用較弱。生防細(xì)菌方面, 生物質(zhì)炭可顯著增加芽孢桿菌BA1和BA2、假單胞菌PS1和PS2、鏈霉菌ST1和ST4及鞘氨醇單胞菌SP1和SP2的數(shù)量, 對芽孢桿菌BA3、假單胞菌PS3和鏈霉菌ST5數(shù)量也有較強(qiáng)的增加作用。芽孢桿菌BA1、BA2和BA3與鏈霉菌ST1、ST4和ST5在平板上對辣椒疫霉菌具有強(qiáng)抑制作用, 而假單胞菌PS1、PS2和PS3與鞘氨醇單胞菌SP1和SP2抑制作用較弱或者沒有抑制作用(表3)。通過定殖復(fù)篩, 有效剔除了初篩菌株中的假性生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌, 進(jìn)一步明確了生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌菌株。

2.4 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防菌抑制辣椒疫霉的效果

圖1a為在對照土壤和生物質(zhì)炭土壤中添加各生防真菌對辣椒疫霉數(shù)量的影響。對照土壤中, 木霉菌、青霉菌和曲霉菌菌株均能顯著減少辣椒疫霉數(shù)量, 菌株P(guān)E1和AS2效果最佳。在生物質(zhì)炭土壤中, 木霉菌、青霉菌和曲霉菌菌株也均能顯著減少辣椒疫霉數(shù)量, 木霉菌TR1和TR3、青霉菌PE1和曲霉菌AS2效果最佳。另外, 在無生防菌添加下, 施用1.33%生物質(zhì)炭可顯著減少18.44%辣椒疫霉數(shù)量。對照組和生物質(zhì)炭組對比分析顯示, 生物質(zhì)炭組的TR1、TR3、AS1和AS2處理辣椒疫霉數(shù)量分別是對照組對應(yīng)處理的75.6%、62.0%、70.8%和65.9%, 可見木霉菌TR1和TR3及曲霉菌AS1和AS2與生物質(zhì)炭有協(xié)同抑制辣椒疫霉作用。

圖1b為在對照土壤和生物質(zhì)炭土壤中添加各生防細(xì)菌對辣椒疫霉數(shù)量的影響。在對照土壤中, 芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌菌株均能顯著減少辣椒疫霉數(shù)量, 芽孢桿菌效果最佳, 其次是鏈霉菌, 鞘氨醇單胞菌對辣椒疫霉數(shù)量沒有抑制作用。在生物質(zhì)炭土壤中, 所有芽孢桿菌和鏈霉菌及兩株假單胞菌(PS1和PS3)也均能顯著減少辣椒疫霉數(shù)量, 芽孢桿菌 BA1、BA2、BA3和假單胞菌PS1效果最佳, 其次是鏈霉菌 ST1、ST4、ST5和假單胞菌PS3, 鞘氨醇單胞菌對辣椒疫霉數(shù)量沒有抑制作用。另外, 在無生防菌添加下, 施用1.33%生物質(zhì)炭可顯著減少27.54%辣椒疫霉數(shù)量。對照組和生物質(zhì)炭組對比分析顯示, 芽孢桿菌BA1和BA2、假單胞菌PS1和PS3及鏈霉菌ST1在生物質(zhì)炭存在時(shí)削減辣椒疫霉數(shù)量效果顯著強(qiáng)于無生物質(zhì)炭時(shí), 生物質(zhì)炭組的BA1、BA2、PS1、PS3和ST1處理辣椒疫霉數(shù)量分別是對照組對應(yīng)處理的53.1%、66.0%、31.5%、64.4%和75.0%, 可見芽孢桿菌BA1和BA2、假單胞菌PS1和PS3及鏈霉菌ST1與生物質(zhì)炭有協(xié)同抑制辣椒疫霉作用。

3 討論

本研究再次證明生物質(zhì)炭可有效防控辣椒疫病, 并且可顯著降低土壤中辣椒疫霉數(shù)量。由此推測, 生物質(zhì)炭降低土壤中病原菌數(shù)量可能是其防控辣椒疫病的直接原因。Jaiswal等[8]的研究顯示生物質(zhì)炭施用下番茄枯萎病病原菌()數(shù)量和發(fā)病率顯著降低, 這與根際可培養(yǎng)木霉菌、熒光假單胞菌和放線菌等有益微生物數(shù)量增加有關(guān)。本研究中生物質(zhì)炭能顯著提高辣椒根際中的木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌等具有潛在生防作用的有益微生物數(shù)量, 這可能與辣椒疫霉數(shù)量削減有直接關(guān)系。多項(xiàng)研究也表明了施用生物質(zhì)炭可增加土壤中木霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌等有益微生物數(shù)量[8,13-14,19,22]。木霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌是應(yīng)用廣泛的常見生防菌, 能促進(jìn)作物生長、產(chǎn)生抑制病原菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性并抑制土傳病害, 且在辣椒疫病防控方面的報(bào)道也較多[23-26]。此外, 也有文獻(xiàn)報(bào)道鞘氨醇單胞菌對作物生長具有促進(jìn)作用[27]。

表3 生物質(zhì)炭對辣椒根際土壤生防菌的定殖影響

真菌拮抗強(qiáng)度: +、++、+++、++++、+++++分別表示重寄生長度為0~4 mm、4~8 mm、8~12 mm、12~16 mm和>16 mm,-表示無重寄生現(xiàn)象。細(xì)菌拮抗強(qiáng)度: +、++、+++、++++、+++++分別表示抑菌圈直徑0~3 mm、3~6 mm、6~9 mm、9~12 mm和>12 mm;-表示無抑菌圈。For antagonistic effect of fungal strains, +, ++, +++, ++++ and +++++ represent mycoparasitic lengths of 0-4 mm, 4-8 mm, 8-12 mm, 12-16 mm and > 16 mm, respectively.-represents no inhibition. For antagonistic effect of bacterial strains, +, ++, +++, ++++ and +++++ represent inhibition zone widths of 0-3 mm, 3-6 mm, 6-9 mm, 9-12 mm and > 12 mm, respectively.-represents no inhibition.

通過平板篩選初篩出可能被生物質(zhì)炭富集的潛在生防菌菌株, 再通過定殖復(fù)篩剔除不能被生物質(zhì)炭在辣椒根際中富集的假性生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物, 明確可被生物質(zhì)炭富集的潛在生防菌為18株木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌株。木霉菌可有效降解生物質(zhì)炭有機(jī)成分[28], 鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌可分泌相關(guān)酶降解生物質(zhì)炭芳香組分[29-30], 這可能是木霉菌、鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌在添加生物質(zhì)炭土壤中得到增殖的原因。Kolton等[31]的研究也表明生物質(zhì)炭可增加降解酚類和芳香族化合物的細(xì)菌種類, 例如放線菌科和鞘氨醇單胞菌科。青霉菌和曲霉菌與木霉菌同屬一科, 也是較為常見的生防真菌[32-33], 也可能通過降解生物質(zhì)炭組分進(jìn)而得到增殖。

在生物質(zhì)炭土壤和對照土壤中, 添加各介導(dǎo)生防真菌均能顯著減少辣椒疫霉數(shù)量。生防真菌抑制疫霉數(shù)量效果與其平板抑制效果不一致?？梢? 利用平板拮抗病原菌效果評價(jià)生防真菌效果具有較大的局限性。兩株木霉菌株抑制辣椒疫霉數(shù)量最顯著, 其次為青霉菌PE1與曲霉菌AS2和AS1。此外, 該5株菌株均可與生物質(zhì)炭協(xié)同抑制辣椒疫霉數(shù)量。因此, 生物質(zhì)炭介導(dǎo)的生防真菌在生物質(zhì)炭存在下更能抑制辣椒疫霉數(shù)量。

圖1 土壤添加生防真菌(a)和細(xì)菌(b)對辣椒疫霉數(shù)量的影響

CK為未添加生物碳的空白對照土壤, BC為添加13.3 g?kg-1生物質(zhì)炭土壤; PC為無生防菌添加, TR1、TR3為木霉菌菌株, PE1、PE2、PE3為青霉菌菌株, AS1、AS2為曲霉菌菌株, BA1、BA2、BA3為芽孢桿菌菌株, PS1、PS2、PS3為假單胞菌菌株, ST1、ST4、ST5為鏈霉菌菌株, SP1、SP2為鞘氨醇單胞菌菌株。不同小寫字母表示不同菌株處理間差異顯著(<0.05)。不同大寫字母表示同一菌株的空白對照與生物質(zhì)炭添加處理差異顯著(<0.05)。CK: control soil without biochar; BC: biochar-amended soil. PC: control without biocontrol agent.TR1 and TR3 arestrains; PE1, PE2 and PE3 arestrains; AS1 and AS2 arestrains; BA1, BA2 and BA3 arestrains; PS1, PS2 and PS3 arestrains; ST1, ST4 and ST5 arestrains; SP1 and SP2 arestrains. Different lowercase letters indicate significant differences among different strains at< 0.05. Different capital letters indicate significant differences between CK and BC at< 0.05.

生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防細(xì)菌方面, 芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌菌株在平板上均對辣椒疫霉有抑制作用。與之相符, Jaiswal等[34]的研究顯示可被生物質(zhì)炭富集的幾株假單胞菌和芽孢桿菌菌株對黃瓜猝倒病病原菌()均有強(qiáng)平板拮抗作用。生防細(xì)菌菌株抑制辣椒疫霉數(shù)量效果與平板拮抗能力具有較高的吻合度, 在生物質(zhì)炭土壤和對照土壤中, 芽孢桿菌、鏈霉菌和假單胞菌菌株抑制辣椒疫霉作用較強(qiáng), 而鞘氨醇單胞菌菌株作用較弱或者無作用。另外, 生物質(zhì)炭介導(dǎo)的生防細(xì)菌與生物質(zhì)炭具有協(xié)同抑制辣椒疫霉數(shù)量作用, 主要表現(xiàn)在芽孢桿菌, 其次是鏈霉菌和假單胞菌。因此, 與生防真菌類似, 生物質(zhì)炭介導(dǎo)的生防細(xì)菌在生物質(zhì)炭存在下更能抑制辣椒疫霉數(shù)量。

生物質(zhì)炭具有高度多孔性和較高比表面積, 可為細(xì)菌、放線菌和真菌的生存繁殖提供棲息地, 且利于微生物躲避土壤掠奪性動(dòng)物的侵襲[2-3]。近年來, 多有研究以生物質(zhì)炭作為功能菌載體以增強(qiáng)生物炭或功能菌的作用效果[23,35-36]。生物質(zhì)炭吸附枯草芽孢桿菌SL-13可協(xié)同增強(qiáng)土壤肥力和植株促生長作用[37]。生物質(zhì)炭聯(lián)合有益菌菌液可協(xié)同增強(qiáng)土壤生物學(xué)性狀改善效果, 有效減輕蘋果連作障礙[38]。本研究中, 生物炭與其介導(dǎo)生防菌可協(xié)同增強(qiáng)抑制辣椒疫霉作用。因此, 我們推測將生物炭與介導(dǎo)生防菌等有效聯(lián)合可研制出生防菌強(qiáng)化型炭基土壤改良劑, 在提高生防菌定殖量和時(shí)效性的基礎(chǔ)上增強(qiáng)防病和改善土壤性狀作用, 這值得深入研究。

4 結(jié)論

生物質(zhì)炭防控辣椒疫病與其介導(dǎo)下的有益微生物具有密切關(guān)系。生物質(zhì)炭富集的主要防病有益微生物是木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌, 而對生物質(zhì)炭防病貢獻(xiàn)較大的為木霉菌、曲霉菌和芽孢桿菌。此外, 生物質(zhì)炭介導(dǎo)生防微生物中, 與生物質(zhì)炭具有協(xié)同抑制辣椒疫霉作用的主要是木霉菌、曲霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和鏈霉菌。將生物質(zhì)炭與其介導(dǎo)生防菌同時(shí)施用以提高防病效果具有重大研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Inhibitory effect of biochar-enriched biocontrol agents on*

WANG Guangfei1, MA Yan1**, GUO Dejie1, LUO Jia1, LIANG Yonghong2, QIU Meihua2

(1. Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Agro-Environment in Downstream of Yangtze Plain, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014, China; 2. Jiangsu Province Station of Farmland Quality and Agro-Environmental Protection, Nanjing 210036, China)

Biochar is known to effectively control the Phytophthora blight of pepper. To further understand the mechanisms of biochar-mediated disease control, we screened the biochar-enriched beneficial microorganisms and evaluated their antagonistic activities against. A pot experiment was conducted to determine the effects of straw biochar on the control of Phytophthora blight. Both qPCR and dilution-plate methods were used to identify the biochar-enriched biocontrol microorganisms in rhizosphere soils. Potential antagonistic strains, which were biochar-enriched, were screened using the selective isolation method and rhizosphere colonization assay, after which their antagonistic activity againstin soil was determined. The results showed that biochar amendment could significantly reduce the abundance ofand severity of the Phytophthora blight of pepper by 95.1% and 91.1%, respectively. In addition, biochar amendment significantly increased the abundances of,,,,,andby 2.22, 4.09, 3.89, 2.45, 1.45, and 1.30 times, respectively. Twenty-two potential biocontrol strains that can be enriched by biochar were screened from biochar-amended rhizosphere soils using the selective isolation method. Comparing the colonization between the biochar-amended and control rhizosphere soils, two strains of, three strains of, two strains of, three strains of, three strains of, three strains of, and two strains ofwere confirmed to be enriched by biochar.(TR1 and TR3),(PE1),(AS1 and AS2),(BA1, BA2, and BA3),(PS1 and PS3),and(ST1, ST4, and ST5) strains could significantly reduce the abundance ofin the soil. Among these antagonistic stains,(TR1 and TR3),(AS1 and AS2),(BA1 and BA2),(PS1 and PS3), and(ST1) strainsin synergism with biochar facilitated a significant increase in the inhibition of. Thus,,,,, andenriched by biochar might play an import role in the suppression of Phytophthora blight of pepper under biochar amendment.

Biochar; Biocontrol fungi; Biocontrol bacteria;

, E-mail: myjaas@sina.com

Jan. 3, 2019;

Mar. 6, 2019

S154.3

2096-6237(2019)07-1015-09

10.13930/j.cnki.cjea.190009

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* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0201208)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471949)和江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金[CX(17)2025]資助

馬艷, 主要研究方向?yàn)橹参餇I養(yǎng)與生物資源利用。E-mail: myjaas@sina.com

王光飛, 主要研究方向?yàn)橥寥牢⑸飳W(xué)。E-mail: wy_wgf@163.com

2019-01-03

2019-03-06

* This study was supported by the National Key Research and Development Project of China (2018YFD0201208), the National Natural Science Foundation of China (31471949) and the Funds for Independent Innovation of Agricultural Science and Technology in Jiangsu Province [CX(17)2025].