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      湘西山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗氧化、抑菌活性研究

      2019-07-08 02:58:54張敏
      關(guān)鍵詞:抑菌活性抗氧化活性氣相色譜

      張敏

      【摘要】目的:研究湘西山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分,及其抗氧化活性、抑菌作用,為山莓葉揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。方法:采用水蒸氣蒸餾法提取山莓葉揮發(fā)油,通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)確定其中化學(xué)成分與相對百分含量。運用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法評價山莓葉揮發(fā)油清除自由基能力,刃天青96孔板微量稀釋法測試五種供試菌的抑菌作用。結(jié)果:鑒定山莓葉揮發(fā)油19種成分,占揮發(fā)油總質(zhì)量的87.54%,其中酚類及含氧衍生物63.55%,烴類19.79%,酯類2.54%,醛類1.66%。山莓葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除呈量效關(guān)系,但效果弱于蘆丁和Vc,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌等五種供試菌均有抑菌作用,其中對痢疾志賀桿菌MIC為15.6μg/mL,效果明顯好于卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)論:山莓葉揮發(fā)油體外抗氧化能力相對較弱,對痢疾志賀桿菌抑制作用顯著。

      【關(guān)鍵詞】山莓葉;揮發(fā)油;氣相色譜-質(zhì)譜;抗氧化活性;抑菌活性

      【中圖分類號】R285.5【文獻標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517(2019)8-0040-04

      Abstract:ObjectThechemicalcomposition,antioxidantandantimicrobialactivitiesofthevolatileoilofRubuscorchorifoliusL.f.leaveswereinvestigated.MethodThevolatileoilwasextractedbysteamdistillation,identifiedbyGC/MSanddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theantioxidantactivityoftheoilwastestedby1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)method,theantibacterialactivitywasevaluatedbyrenzurinmicroplateassay.ResultAtotalof19componentswereidentified,themainconstituentswerephenolderivatives(63.55%),alkanes(19.79%),esters(2.54%),aldehydes(1.66%)andetc.ThevolatileoilrevealedacertainscavengingeffectonDPPHfreeradical,theclearanceeffectwasweakerthanrutinandVc.Thevolatileoilhadacertainantibacterialeffectonescherichiacoli,staphylococcusaureus,bacillusthuring-iensis,salmonella,shigelladusenterlea.Minimuminhibitoryconcentrationtoshigelladusenterleawas15.6μg/mL,thatislowerthanconcentrationofkalafunginstandard.ConclusionvolatileoilfromRubuscorchorifoliusL.f.leavesshowedweakantioxidantandcertaininhibitioneffectonshigelladusenterlea.

      Keywords:RubuscorchorifoliusL.f.leaves;VolatileOil;GasChromatography-massSpectrometry;Antioxidant;Antibacterial

      山莓(RubuscorchorifoliusL.f.),又名三月泡,系薔薇科Rosaceae,薔薇亞科懸鉤子屬RubusL.中的一種落葉灌木[1-2]。山莓根、莖、葉、果實均可入藥。根性味微苦、辛、平,具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、解毒斂瘡的功效,主治痢疾、遺精、濕疹、毒蛇咬傷、閉經(jīng)痛經(jīng)、風(fēng)濕腰痛、小兒疳積等癥[3-4],未成熟果實性味微甘、酸、溫,具有化痰解郁、醒酒止渴、澀精益腎、助陽明目之功效,常用于替代覆盆子入藥做引[5-6],主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥。葉性微苦,具有解毒、消腫、斂瘡、清熱利咽等作用,主治咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥[7]。在湖南湘西山莓作為苗族藥治療腹瀉,療效確切[8]。目前湘西山莓葉及其揮發(fā)油的化學(xué)成分及抑菌活性雖見報道[9-10],但考慮到生態(tài)環(huán)境的多樣性,意味著二次代謝產(chǎn)物的多樣性,本實驗對湘西張家界山莓葉提取揮發(fā)油,GC-MS鑒定化學(xué)成分,DPPH法評價自由基清除能力[11-12],刃天青96孔板微量稀釋法測定抑菌活性[13],試圖更詳細(xì)探明山莓葉揮發(fā)油其醫(yī)藥和保健作用的內(nèi)在本質(zhì),以期更好地綜合開發(fā)利用湘西山莓資源,提供重要的參考依據(jù)。

      1材料

      山莓葉采自吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山,由吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物山莓R.corchorifoius的葉,陰干,粉碎后備用石油醚(沸程30~60℃)、無水硫酸鈉、氯化鈉、蒸餾水、DPPH自由基、無水乙醇、VC、蘆丁、卡拉霉素、刃天青(Resazurin)、甲醇以上試劑均為分析純ThermoDSQ-IIGC-MS聯(lián)用儀(美國賽默飛科技公司)、紫外分光光度計、MultiskanFC酶標(biāo)儀(美國賽默飛科技公司)、pH酸度計(HM-205日本TOA公司)、烘箱(DN-63日本yamato公司)、培養(yǎng)箱(PW/10-002重慶實驗設(shè)備廠)、超凈工作臺(CCV-1311日本日立公司)、冰箱、高壓蒸汽滅菌器(SM-52、日本)1/萬天平(AEG-220日本島津)、水蒸氣蒸餾裝置、電子天平、真空干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥器、FD-1冷凍干燥機。

      2方法

      2.1山莓葉揮發(fā)油的提取稱取600.00g山莓葉粉于揮發(fā)油提取器中,加3000mL蒸餾水加熱提取,收集蒸出液,再加入NaCl直至蒸出液飽和,然后用30~60℃的石油醚萃取,無水硫酸鈉脫水,石油醚萃取液于37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,即得山莓葉揮發(fā)油。

      2.2GC-MS檢測條件色譜條件:石英毛細(xì)管柱BP×5(25m×0·22mm×0·25μm);起始溫度40℃,保持3min,以5.0℃/min的升溫速率升到220℃,保持5min;進樣溫度230℃,分流比30∶

      1,進樣量1μL,載氣為氦氣,流速為1.0mL/min;質(zhì)譜條件:離子源EI,離子源溫度250℃,電子能量70eV,發(fā)射電流:120μA,掃描范圍30~500amu。定性分析:Mainlib譜庫檢索,確定成分,峰面積歸一化法確定相對含量。

      2.3山莓葉揮發(fā)油清除DPPH自由基準(zhǔn)確稱取12.5mgDPPH·無水乙醇溶解定容,配制成50μg/mL儲備液(現(xiàn)用現(xiàn)配),即為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取0、2、4、6、8mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液在25mL容量瓶中定容,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為:0、4、8、12、16μg/mL。在517nm處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      稱取0.2325g山莓葉揮發(fā)油于25mL容量瓶中,無水乙醇溶解定容,再分別取0、0.1、0.25、0.5、1mL于10mL容量瓶中與5mL濃度為40μg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液混合,乙醇定容,山莓葉揮發(fā)油濃度依次為0、93、232.5、460、930μg/mL。517nm處動態(tài)測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到DPPH·殘留量。繪制不同濃度的揮發(fā)油與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

      DPPH·殘留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%式中:[DPPH·]T為某一時刻DPPH·的質(zhì)濃度;[DPPH·]T0為DPPH·的起始質(zhì)量濃度。

      各自稱取5.00mg蘆丁、Vc于分別100mL容量瓶,無水乙醇定容,即得蘆丁、Vc儲備液。分別取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5mL儲備液于10mL容量瓶,與5mL濃度為40μg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液混合,乙醇定容,即分別得蘆丁、Vc系列溶液為0、2.5、5、7.5、10、12.5μg/mL,搖勻。在517nm處的吸光度,繪制不同濃度的Vc、蘆丁與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

      2.4刃天青顯色法檢測山莓葉揮發(fā)油抑菌活性菌懸液的制作:各細(xì)菌株在實驗室活化后繼代培養(yǎng),并于冰箱內(nèi)4℃下保存一部分。用之前先將各細(xì)菌株在NA培養(yǎng)基上活化,且以MHB繼代培養(yǎng)菌株2~3代,并在試驗的前一天繼代培養(yǎng)一次,以保證菌的生長能力達到最佳。用分光光度計測定每株細(xì)菌菌液的OD600(大腸桿菌在OD600=0.1時的菌濃約為108CFU/mL,其他細(xì)菌參照此數(shù)值)。用MHB培養(yǎng)基將菌液稀釋到1×108CFU/mL的濃度。取5mL菌液和7.5mL的刃天青指示劑儲備液混勻,用排槍吸取100μL菌液加入96孔板,除無菌對照孔外。

      供測試樣品和陽性對照的儲液的配制:將揮發(fā)油于-10℃條件下靜置24h,冷凍分層,分離上下層。用乙醇將揮發(fā)油、冷凍后揮發(fā)油的上下層及標(biāo)準(zhǔn)品配制成最大濃度為1.00mg/mL的儲液,然后以倍比稀釋,共配制1.00~1.95μg/mL十個濃度儲備液。將上述儲備液加入96孔板,每孔2μL;留無菌對照孔和生長對照孔。

      刃天青指示劑配制成750μg/mL儲備液,分別取取5mLMHB培養(yǎng)基和7.5mL的刃天青指示劑儲備液混勻,用排槍吸取100μL加入96孔板的無菌對照孔。

      最低抑菌濃度(MIC)的測定:將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)。每5~6小時觀察一次,有細(xì)菌生長的孔逐漸由藍色變粉,其中無菌的陰性對照孔為藍色,細(xì)菌陽性對照空為亮紅色,以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度(MIC)值。

      3結(jié)果與分析

      3.1山莓葉揮發(fā)油的提取水蒸氣蒸餾法提取山莓葉得到揮發(fā)油0.2325g,山莓葉揮發(fā)油的得率為0.03875%。

      3.2山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析山莓葉揮發(fā)油總離子流圖如圖1所示,其組成成分及相對含量見表1。由表1可知,確定了其中的19種成分,占總揮發(fā)油總量的98.49%,其中主要成分為4-甲基-2,5-二叔丁基苯酚(45.46%),2,3-二甲基戊烷(19.79%),2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(18.09%),2,5-十八碳二炔酸甲酯(2.54%)紫蘇醛(1.66%)等。

      3.3山莓葉揮發(fā)油DPPH法抗氧化活性分光光度法測定DPPH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在517nm處的吸光值,結(jié)果見圖2,作線性回歸分析,得到線性回歸方程為y=0.0351x+0.0445,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,表明DPPH自由基濃度與其吸光度呈即顯著正相關(guān)關(guān)系。

      山莓葉揮發(fā)油、Vc和蘆丁對DPPH自由基均有清除能力,隨著樣品濃度的增加,清除效果越好,而且山莓葉揮發(fā)油和Vc的清除速度比蘆丁要快,如圖3、圖4、圖5所示,當(dāng)DPPH·自由基殘留率為50%時,山莓葉揮發(fā)油濃度為121.9μg/mL、Vc濃度為4.8μg/mL、蘆丁為6.3259μg/mL,由此可知山莓葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力明顯低于Vc和蘆丁,山莓葉揮發(fā)油對DPPH抗氧化活性相對較弱。

      3.4山莓揮發(fā)油抑菌活性刃天青顯色抑菌活性測試結(jié)果見表2,表明山莓葉揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌均有一定的抑菌作用,而且對痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度(MIC)達到31.25μg/mL。揮發(fā)油冷凍下層對痢疾志賀氏桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為15.6μg/mL,低于卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品。

      4討論

      通過GC-MS技術(shù)對湘西張家界山莓葉揮發(fā)油的化學(xué)成分進行鑒定分析,可知其主要成分為酚類及其含氧衍生物(63.55%),烷烴類(19.79%),酯類(2.54%)醛類(1.66%)等,比較周雙德測定的山莓葉揮發(fā)油的主要成分烷類(62.71%)、酯類(7.57%)、酚類(2.6%)、醇類(2.17%),程怡測定的主要成分烷類(37.4%)、醇類(16.33%)、酯類(6.52%)、酚類(2.6%)、測定成分及含量均存在差異,有待進一步研究。DPPH法結(jié)果表明湘西山莓揮發(fā)油抗氧化能力相對弱于蘆丁和Vc。此外,刃天青96孔板微量稀釋顯色法與K-B紙片法相比較,分析方法靈敏,結(jié)果穩(wěn)定,需要的試劑和樣品量少,適合植物提取分離所得少量樣品的抑菌活性篩選,在實驗中發(fā)現(xiàn)山莓葉揮發(fā)油對痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度達到15.6μg/mL,比卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑菌效果更好,是一種潛在的抗菌藥源,有待進一步研究開發(fā)。綜上所述山莓葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化和良好的抑菌能力,作為天然抑菌劑和抗氧化劑具有良好的開發(fā)前景,同時也為湘西山莓開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

      參考文獻

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      (收稿日期:2019-02-15編輯:程鵬飛)

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