郝爾娃，吳 岳*，楊應(yīng)忠，馬啟寧，趙洪乾，于 聰

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 816000；2.青海省海西州公安局油沙山分局，青海 茫崖 816400)

法醫(yī)病理學(xué)中死亡時(shí)間(Post Mortem Interval，PMI)的推斷一直沒有明確統(tǒng)一的計(jì)算方法，是法醫(yī)尸檢工作中的一大難點(diǎn)。

應(yīng)用核酸推斷死亡時(shí)間是法醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，其中環(huán)狀RNA(circRNAs)作為一類新近發(fā)現(xiàn)的分子，在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用還在研究階段，尚未有太多的研究資料。本研究將使用q-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠小腦中環(huán)狀RNA相對(duì)表達(dá)含量，分析circRNA用于推測(cè)PMI的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器：ABI 7500 RT-qPCR儀(美國(guó)ABI公司)，UVP 凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)，5415D高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，NanoDrop 2000c核酸分析儀(美國(guó)Thermo公司)，BIO-RAD PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂公司)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，鼎池12 L雙核制冷醫(yī)用恒溫箱(艾威雷博公司)。

試劑：天根總RNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)公司)，TIANGEN GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技公司)，TIANGEN SuperReal PreMix Color(SYBR Green)SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑(北京天根生化科技公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

成年雄性昆明小鼠50只，SPF級(jí)，體重均為25 g左右，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003]，在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與處理

50只昆明小鼠隨機(jī)分為兩個(gè)溫度組(4℃組和20℃組)，每大組25只，用斷頸法處死，置于4 ℃恒溫箱和20 ℃恒溫箱。每個(gè)大組的小鼠按照死亡時(shí)間分為死后0、24、48、96、168 h組，每小組5只小鼠。在相應(yīng)時(shí)間解剖小鼠，取小腦組織用液氮迅速冷凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存。以候選的四種引物分別作為候選內(nèi)參計(jì)算△CT值(△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因)，并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量2-△CT，帶入NormFinder程序中求各個(gè)基因的穩(wěn)定性M值，M值最小的即為最適內(nèi)參基因。除內(nèi)參基因外的circRNA都作2-△△CT轉(zhuǎn)換[△△CT=實(shí)驗(yàn)組(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)-對(duì)照組(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)]，轉(zhuǎn)換后數(shù)值代表處理組相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)量的倍數(shù)。

1.3.2 總RNA提取及q-PCR分析

取小腦組織500 mg，于液氮中研碎，加入1 mL裂解液RZ后做勻漿處理，按照說明書步驟提取總RNA，用40 μL RNase-Free ddH2O溶解RNA，使用NanoDrop2000c核酸分析儀檢測(cè)濃度與OD值，并做核酸凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制成20 μL cDNA(體系)。使用TIANGEN SuperReal PreMix Color(SYBR Green)SuperReal彩色熒光定量試劑進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)中所使用的circRNAs引物均為外向型引物，由上海捷瑞公司合成，序列見表1。

表1 被檢指標(biāo)RNA引物序列Table1 Target circRNA primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參篩選結(jié)果

circRNA缺少5′和3′末端，不易被核酸外切酶降解，因而比線狀RNA性質(zhì)更加穩(wěn)定[1]。本實(shí)驗(yàn)中除circRNA指標(biāo)外，另加了一項(xiàng)常用線性內(nèi)參基因——管家基因β-actin，篩選適用于circRNA定量的內(nèi)參指標(biāo)。結(jié)果如表2所示，CDR1as的M值為0.417，更適合作為本實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參基因。

表2 NormFinder計(jì)算候選內(nèi)參穩(wěn)定值(M值)結(jié)果Table2 Expression stability values(M value)of candidate reference genes with NormFinder

2.2 單因素方差分析結(jié)果

小鼠死后在不同死亡時(shí)間及溫度下，小腦中目的基因相對(duì)表達(dá)量2-△△CT的結(jié)果如表3所示，折線圖見圖1。4 ℃組與20 ℃組的Rims2 circRNA及Dym circRNA在死后24 h內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，24 h后呈緩慢降低趨勢(shì)(P<0.05)。

表3 死后各時(shí)間組目的基因相對(duì)表達(dá)量 Table3 Relative expression levels of each target genes at different

*：與同組同一目的基因0 h組相比，P<0.05

圖1 4 ℃組(左)與 20 ℃組(右)目的基因相對(duì)表達(dá)量隨PMI變化趨勢(shì)圖Figure 1 The changes of relative expression of the target genes in the group 4 ℃(left)and the group 20 ℃(right)with PMI

2.3 線性回歸分析結(jié)果

對(duì)不同溫度下的兩種circRNA的△Ct值與PMI進(jìn)行回歸分析，其中PMI作為自變量x，△Ct值作為因變量y，作線性、二次及三次曲線估計(jì)，分別得到三條線性模型，結(jié)果如表4所示。4 ℃組Rims2 circRNA的三次回歸模型的決定系數(shù)r2=0.752，P<0.05，Dym circRNA的三次回歸模型r2=0.834，P<0.05，說明4 ℃組的PMI對(duì)△Ct值的影響很大；20 ℃組Rims2 circRNA的二次回歸模型與三次回歸模型的r2值相同，r2=0.544，且P<0.05，Dym circRNA的三次回歸模型r2=0.512，且P<0.05，說明4 ℃組的PMI對(duì)△Ct值的影響較大。

表4 PMI與△Ct值回歸分析結(jié)果Table4 The results of PMI and △Ct value regression analysis

3 討論

死亡時(shí)間按時(shí)間經(jīng)歷長(zhǎng)短分為早期死亡時(shí)間和晚期死亡時(shí)間。早期死亡時(shí)間是指死后經(jīng)歷時(shí)間在24 h之內(nèi)，在這段時(shí)間內(nèi)最簡(jiǎn)單且基礎(chǔ)的方法是根據(jù)溫度來推斷，死后10 h內(nèi)，每過1 h尸溫下降1 ℃，而10 h之后每小時(shí)下降0.5 ℃，在此結(jié)果上夏季相對(duì)春秋季要慢1.4倍，冬季快0.7倍。德國(guó)埃森大學(xué)Claus HenΒge教授創(chuàng)建了綜合參數(shù)法[2]，在尸溫降解曲線的基礎(chǔ)上矯正體重參數(shù)，并結(jié)合尸僵、尸斑、胃內(nèi)容物消化程度等尸體變化規(guī)律進(jìn)行多參數(shù)綜合推斷。晚期死亡時(shí)間是指死亡發(fā)生24 h以后，這時(shí)的尸體發(fā)生了腐敗等一系列變化，會(huì)使尸體發(fā)生不同程度的損毀，致使推斷死亡時(shí)間的難度大大增加，常用的有尸體蠅蛆的發(fā)育規(guī)律[3]、尸體周圍的植物、尸體的組織酶活性[4]及細(xì)胞核酸含量[5，6]等方法。

本實(shí)驗(yàn)中，circRNA在24 h內(nèi)的降解幅度明顯大于24 h以后，說明circRNA在24 h以內(nèi)的變化較大，24 h以后放緩?；貧w分析可見兩種circRNAs的三次回歸方程的回歸系數(shù)更大一些，說明其受PMI的影響較大。

近年來運(yùn)用DNA和RNA的降解規(guī)律來推測(cè)死亡時(shí)間成為法醫(yī)工作者的一大研究熱點(diǎn)[7]。目前對(duì)DNA的檢測(cè)方法主要有流式細(xì)胞儀檢測(cè)法(FCM)[8]，用其檢測(cè)DNA降解率(明確與PMI的相關(guān)性)；單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)法(SCGE)，用其檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷(明確與PMI的關(guān)系)；計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)法(LAT)，用其檢測(cè)細(xì)胞DNA含量[5]；顯微拉曼光譜分析法，用其檢測(cè)死亡后的組織細(xì)胞DNA含量(明確與PMI的關(guān)系)[9]。DNA相對(duì)穩(wěn)定，且具有較為全面和精確的檢測(cè)方法，常用作推測(cè)死亡時(shí)間的可靠指標(biāo)。

RNA的定量檢測(cè)與PMI的相關(guān)性研究中，除了經(jīng)典的tRNA，mRNA和rRNA之外，還包含其他類型的RNA，包括miRNA，lncRNA，piRNA，siRNA，tmRNA，sRNA，tiRNA，eRNA，snoRNA，snRNA和其他非編碼RNA。在諸多的RNA分子家族中，有一類環(huán)狀RNA在數(shù)量和類型上的發(fā)現(xiàn)都在不斷增多，引發(fā)越來越多的關(guān)注[10]。目前已知具有環(huán)狀RNA分子的結(jié)構(gòu)有：具有環(huán)狀基因組RNA的類病毒和丁型肝炎病毒(HDV)；內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA分子；在rRNA和tRNA形成過程中的環(huán)狀中間體；一些功能性非編碼的環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)；以及在真核生物pre-mRNA反向剪接生成mRNA過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物circRNAs，此類環(huán)狀RNA最早見報(bào)道于1979年[11]。后經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)[1，12，13，14]，真核生物中的環(huán)狀RNA在哺乳動(dòng)物腦中含量較為豐富且序列高度保守，并且在神經(jīng)分化過程中具有特異性表達(dá)和動(dòng)態(tài)表達(dá)的特性。由于特殊的閉合結(jié)構(gòu)，使得環(huán)狀RNA對(duì)核酸外切酶的敏感性非常低，大約比線狀RNA的敏感性低十倍。這也是本實(shí)驗(yàn)使用環(huán)狀RNA作為推斷死亡時(shí)間的指標(biāo)的主要原因之一。

無論是應(yīng)用DNA還是RNA推斷死亡時(shí)間，受環(huán)境溫度、濕度，死亡原因，死前損傷情況，死者胖瘦、患病與否的影響較大[15]，并與取材部位有關(guān)，想要準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間需要多方法多參數(shù)聯(lián)合考量，并根據(jù)不同地方的不同氣候條件綜合出適宜的綜合參數(shù)。CircRNA在死亡時(shí)間的推斷中雖不能使推斷更加準(zhǔn)確，但作為一類新的分子學(xué)指標(biāo)，可以與其他指標(biāo)一起綜合應(yīng)用。

本研究限定了小鼠死后尸體存放條件，探究恒溫恒濕條件下小鼠死后小腦circRNA與死亡時(shí)間的相關(guān)性，具有一定的局限性。此外，小鼠與人體存在明顯的差異，同樣的推斷死亡的方法是否適用于人體尚需明確。