陳 鑫，李芳蓉，張建軍，車樹理，安志剛，楊文璽

（甘肅中醫(yī)藥大學 藥學教學部，甘肅 定西 743000）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源短缺問題日漸突出，以致“人畜爭糧”，尤其是蛋白飼料的不足，嚴重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此，積極利用各種廢棄物開發(fā)新型的蛋白飼料資源是近年來飼料工業(yè)研究的一個熱點，可變廢為寶，實現中藥渣的完全利用，在避免環(huán)境污染的同時，彌補了蛋白飼料短缺的現狀[3]。固態(tài)發(fā)酵相對于液體發(fā)酵，因其具有工藝簡單，設備投資少，能耗低，產率高等特點，在蛋白飼料這種低附加值的產品生產中備受關注[3-5]。隨著世界各國對中醫(yī)的關注和對中藥的重視，給我國中醫(yī)藥事業(yè)的飛速發(fā)展提供了契機，加之市場對中藥產品研發(fā)力度的加大，隨之產生的中藥渣也越來越多，據相關資料表明，全國中藥渣的年排放量已達到6 000萬～7 000萬t[6-9]。中藥渣為中藥材經提取有效成分后剩余的殘渣，含水量較高、極易腐敗，采用傳統(tǒng)的處置方式，如焚燒、填埋或固定區(qū)域堆放，勢必污染環(huán)境，同時造成資源的巨大浪費[10-13]。因此，對中藥渣進行合理利用是實現清潔生產和可持續(xù)發(fā)展的必由之路，是實現中藥現代化進程的一個重要途徑[10，14]。

中藥渣中除了含有一定量的生物活性成分之外，還含有大量的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗多糖、氨基酸、維生素及微量元素等多種營養(yǎng)物質，仍具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[14-17]。通過固態(tài)發(fā)酵技術將中藥渣轉化為蛋白飼料，可實現藥用植物生物量的全利用，在消除環(huán)境污染、緩解蛋白飼料短缺的同時還能帶來一定的經濟效益，為中藥渣的資源化利用開辟了新途徑[6，18-19]。此外，這種新型飼料具有增強動物免疫力、調節(jié)代謝、促進生長、提高產蛋率、降低飼料消耗和改善肉質等保健功效，具有廣闊的應用前景[20]。目前，國內有關中藥渣制備蛋白飼料的研究報道很少。紅芪的根經煎煮提取紅芪多糖后殘留的藥渣除了含有生物活性成分外，還含有大量的蛋白質、纖維素、氨基酸及微量元素等多種營養(yǎng)成分，可作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進一步開發(fā)利用?；谝陨纤悸?，本研究以紅芪藥渣為原料，利用白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）/產朊假絲酵母（Candida utilis）混合菌種對其進行固態(tài)發(fā)酵，采用正交試驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件，為中藥渣發(fā)酵生產蛋白飼料的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）5.776、產朊假絲酵母（Candida utilis）2.281：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心。

1.1.2 中藥渣

試驗所用中藥渣為隴西中天藥業(yè)生產紅芪口服液后殘留的藥渣，濕物料經自然干燥、粉碎、過60目篩后置于干燥器中備用。本次試驗所用藥渣主要成分含量：真蛋白9.47%、粗蛋白11.56%、粗纖維30.58%、還原糖2.63%。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶解，pH自然，121℃濕熱滅菌30 min，用于白腐菌的培養(yǎng)。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁1.0 L，瓊脂20.0 g，加熱溶解，pH自然，121℃濕熱滅菌30 min，用于產朊假絲酵母的培養(yǎng)。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：中藥渣20.0 g，水40.0 g，（NH4）2SO40.8 g，KH2PO40.1 g，K2HPO40.08 g，MgSO40.01 g，NaCl 0.01 g，CaCl20.02 g，放入250 mL三角瓶中，攪拌均勻，121℃濕熱滅菌30 min，用于固態(tài)發(fā)酵試驗。

1.1.4 試劑

硫酸銅、硫酸鈉、硫酸銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硫酸、硼酸、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸等（均為分析純）：天津市光復精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；T6S紫外可見分光光度計：普析通用儀器有限責任公司；QSY半自動凱氏定氮儀：北京強盛分析儀器制造中心；GXP-9270型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：金壇市醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵

將白腐菌、產朊假絲酵母分別在PDA培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基上活化3代后，制成一定濃度的菌懸液或孢子懸液（2×107個/mL），按一定比例接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，恒溫培養(yǎng)一定時間。除特別說明外，發(fā)酵條件為裝料量50%，白腐菌與產朊假絲酵母的接種比1∶1[21-22]，接種量20%，發(fā)酵時間5 d，發(fā)酵溫度30℃。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵產物于70℃烘干，取樣測定真蛋白和粗纖維含量。

1.3.2 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

采用單因素試驗，以發(fā)酵產物中真蛋白和粗纖維含量作為評價指標，分別考察（NH4）2SO4添加量（0、10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g、40 mg/g、50 mg/g干藥渣）、裝料量（25%、50%、75%、100%）、水分含量（0.5 g/g、1.0 g/g、1.5 g/g、2.0 g/g、2.5 g/g、3.0 g/g干藥渣）、發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）對發(fā)酵效果的影響。

1.3.3 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以（NH4）2SO4添加量（A）、裝料量（B）、發(fā)酵時間（C）3個因素為考察因素進行L9（33）正交試驗，以確定最佳工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of Radix hedysari residues

1.3.4 分析測定方法

（1）粗蛋白含量：采用國標GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[23]中的凱氏定氮法測定粗蛋白含量。

（2）真蛋白含量：先用水洗滌去除樣品中可溶性氮源[24]，然后采用凱氏定氮法測定真蛋白含量，并計算出發(fā)酵產物的真蛋白增長率，其計算公式如下：

（3）粗纖維含量：采用酸堿洗滌法[25]測定粗纖維含量，并計算出發(fā)酵產物的粗纖維降解率，其計算公式如下：

（4）還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法[26]測定。

1.3.5 數據分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行數據分析。本次試驗中，每個試驗條件下做3個平行樣，結果為3個平行樣的平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 （NH4）2SO4添加量對發(fā)酵效果的影響

氮是合成蛋白質的重要元素，在微生物生長繁殖過程中發(fā)揮重要作用，紅芪藥渣中氮源相對缺乏，因此需要補充適量氮源。（NH4）2SO4添加量對發(fā)酵效果影響的試驗結果見圖1。

圖1 （NH4）2SO4添加量對發(fā)酵效果的影響Fig.1 Effect of（NH4）2SO4 addition on fermentation

由圖1可知，不同（NH4）2SO4的添加量對發(fā)酵產物中真蛋白和粗纖維含量的影響不同。在不添加（NH4）2SO4的情況下，發(fā)酵產物中的真蛋白含量由原來的9.47%提高至12.82%，粗纖維含量由原來的30.58%降低至26.57%，變化不大。適量地添加（NH4）2SO4有助于菌體蛋白和纖維素酶的合成，從而促進纖維素的降解[3，19，21]。當（NH4）2SO4添加量＜30 mg/g干藥渣之前，發(fā)酵產物中真蛋白含量隨（NH4）2SO4的增加而上升，粗纖維含量隨（NH4）2SO4的增加而降低。當（NH4）2SO4添加量為30 mg/g干藥渣時，發(fā)酵產物中真蛋白含量由原來的9.47%增加至18.56%，比原來提高了95.99%，粗纖維含量由原來的30.58%下降至21.78%，比原來降低了28.78%。當（NH4）2SO4添加量＞30 mg/g干藥渣之后，真蛋白含量和粗纖維含量均有少量增加，這說明此時菌體仍在生長，使菌體蛋白含量繼續(xù)增加，而粗纖維的降解能力減弱?？赡艿脑蚴沁^多的（NH4）2SO4抑制了纖維素酶的合成或降低了纖維素酶的活性，進而減弱了纖維素的降解能力。

2.1.2 裝料量對發(fā)酵效果的影響

適宜的裝料量有助于纖維素的降解和菌體蛋白的生成，因為適宜的裝料量有利于發(fā)酵過程中的氧氣和熱量的傳遞，進而促進微生物的生長代謝。裝料量過多或過少均不利于菌體的生長繁殖，導致蛋白質的生成率降低。裝料量對發(fā)酵效果的影響見圖2。

圖2 裝料量對發(fā)酵效果的影響Fig.2 Effect of material loading on fermentation

由圖2可知，當裝料量＜50%之前，發(fā)酵產物中真蛋白含量隨裝料量的增加而上升，粗纖維含量隨裝料量的增加而降低。當裝料量為50%時，發(fā)酵產物中真蛋白含量最高，為18.02%，比原來提高了90.28%，粗纖維含量最低，為20.62%，比原來降低了32.57%。當裝料量＞50%之后，真蛋白含量逐漸下降，而粗纖維含量逐漸上升。故選擇最佳裝料量為50%。

2.1.3 水分含量對發(fā)酵效果的影響

固態(tài)發(fā)酵最大的特點是游離水較少。水是微生物生長代謝必不可少的物質，也是發(fā)酵的主要媒介物質，因此，培養(yǎng)基中含水量的多少必然影響微生物的生長及代謝能力。水分含量對發(fā)酵效果的影響見圖3。由圖3可知，在固態(tài)發(fā)酵過程中，適宜的含水量可使藥渣顆粒具有良好的蓬松性，有利于微生物的生長和酶的合成，從而增加菌體蛋白含量。水分添加量過多或過少均對菌體蛋白的合成產生不良影響。可能的原因為，水分含量過少時，因水分不足，抑制了微生物的生長代謝；水分含量過多時，藥渣容易產生粘黏現象，透氣性差，溶氧量少，也不利于微生物的生長代謝。當水分含量為2.0 g/g干藥渣時，菌體含量達到最大值，此時發(fā)酵產物中真蛋白含量也最高，為17.86%，增長率為88.60%，粗纖維含量最低，為22.56%，降解率為26.23%。

圖3 水分含量對發(fā)酵效果的影響Fig.3 Effect of moisture content on fermentation

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

適宜的發(fā)酵時間，可得到最大的蛋白產率和粗纖維降解率，同時可降低生產成本。因此，確定適宜的發(fā)酵時間對微生物發(fā)酵具有重要的指導意義。發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響見圖4。由圖4可知，發(fā)酵產物中真蛋白增長率和粗纖維降解率均隨著發(fā)酵時間的延長而增加，在第5天時達到最大值，真蛋白含量為18.72%，粗纖維含量為22.42%，此后隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵產物中真蛋白含量下降而粗纖維含量上升。發(fā)酵時間過短，菌體不能充分利用碳源來生長，發(fā)酵產物中真蛋白含量較低，達不到發(fā)酵目的；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵環(huán)境已不利于菌體生長，菌體易發(fā)生自溶，且易滋生雜菌，同時增加生產成本。故最佳發(fā)酵時間為5 d。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation

2.2 正交試驗結果

由于水分含量對結果影響較小，在單因素試驗的基礎上，對（NH4）2SO4添加量、裝料量、發(fā)酵時間進行3因素3水平正交試驗。由于飼料檢測的國家標準對真蛋白含量和粗纖維含量均有相關要求，因此，本試驗采用雙指標（真蛋白含量和粗纖維含量）分析方法對發(fā)酵效果進行綜合評價。評價方法如下：發(fā)酵產物中真蛋白含量和粗纖維含量的基準分別是15%和23%，真蛋白含量每上升0.1%則加1分，粗纖維含量每下降0.1%則加1分，以此類推。

綜合評分=（真蛋白含量-15%）/0.1%+（23%-粗纖維含量）/0.1%[12]。以發(fā)酵產物中真蛋白含量和粗纖維含量為評價指標，采用雙指標分析方法對發(fā)酵效果進行綜合評價，以確定最佳工藝條件。正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of Radix hedysari residues

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2正交試驗極差分析結果可看出，3個因素對發(fā)酵產物的影響程度依次為（NH4）2SO4添加量＞發(fā)酵時間＞裝料量，即（NH4）2SO4添加量對紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵生產蛋白飼料的影響最大，因為培養(yǎng)基中含氮量的多少直接影響菌體蛋白和纖維素酶的合成，因此在生產中應嚴格控制（NH4）2SO4添加量。3個因素對發(fā)酵產物蛋白含量的影響均不顯著，可能的原因是試驗誤差大且誤差自由度小（僅為2），使檢驗的靈敏度降低，從而掩蓋了因素的顯著性；綜合正交試驗極差分析與方差分析，得到白腐菌/產朊假絲酵母混合菌種固態(tài)發(fā)酵紅芪藥渣的最佳工藝條件為A2B2C2，由表中直觀分析可知，最佳發(fā)酵條件為A2B1C2，故對兩種發(fā)酵條件的結果進行驗證，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Table 4 Results of verification experiments

經測定A2B2C2組合的發(fā)酵產物中真蛋白含量為19.05%，粗纖維含量為19.94%，而A2B1C2組合的發(fā)酵產物中真蛋白含量為18.57%，粗纖維含量為22.24%，說明A2B2C2組合發(fā)酵效果優(yōu)于A2B1C2。因此，最佳工藝條件為A2B2C2，即（NH4）2SO4添加量30 mg/g干藥渣，裝料量50%，發(fā)酵時間5 d。

3 結論

利用白腐菌/產朊假絲酵母混合菌種對紅芪藥渣進行固態(tài)發(fā)酵，以發(fā)酵產物中的真蛋白和粗纖維含量為主要評價指標，采用單因素和正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定了最佳工藝條件為（NH4）2SO4添加量30 mg/g干藥渣、裝料量50%、水分含量2.0 g/g干藥渣、發(fā)酵時間5 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵產物中真蛋白含量達19.05%，粗纖維含量達19.94%。