胡曉磊,吳 迅,馬永輝,張惠玲*
(1.寧夏大學(xué) 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)
馬鈴薯是我國當(dāng)前最具發(fā)展前景的高產(chǎn)糧食作物之一,近年來國家一直提倡增加馬鈴薯深加工產(chǎn)品,提高馬鈴薯附加值[1-2],快速推動(dòng)我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。馬鈴薯是寧夏優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)中的重點(diǎn)支持產(chǎn)業(yè),具有品種優(yōu)良、加工風(fēng)味好、淀粉含量高等優(yōu)勢(shì)[3-6]。其包含了人體所需的各種營養(yǎng)素(如蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)元素等),具有預(yù)防腸胃疾病、抗衰老、抗氧化、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、減少白內(nèi)障、角膜炎等相關(guān)炎癥、排毒、解毒等功能性作用[7]。
紅茶菌是由多種醋酸菌、酵母菌和乳酸菌組成的共生體,俗稱“海寶”、“胃寶”[8],具有抵抗癌癥、提高消化能力、刺激免疫系統(tǒng)、減少發(fā)炎、清理腸胃、幫助消化、預(yù)防和治療便秘和痔瘡、預(yù)防“三高”、結(jié)石及一些心血管疾病、排毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用[9-12]。到目前為止,從各種紅茶菌中分離到的醋酸菌有薩克塔堤查仁桿菌(Tanticharoenia sakaeratensis)、羅旺醋酸桿菌(Acetobacter lovaniensis)、過氧化醋酸桿菌(Acetobacter peroxydans)、蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii)、沖繩醋酸桿菌(Acetobacterokinawensis)、熱帶醋酸桿菌(Acetobacter tropicalis)、醋化醋桿菌(Acetobacter liquefy aciens)等;酵母菌有釀酒酵母(Saccha romyces cerevisiae)、克魯斯假絲酵母(Candiada krusei)、弗洛接合有孢圓酵母(Zygotorulaspora florentina)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等[13];乳酸菌有保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)等。
國內(nèi)現(xiàn)在對(duì)紅茶菌的研究主要集中于發(fā)酵條件優(yōu)化,且都僅局限于搖瓶試驗(yàn),在發(fā)酵罐發(fā)酵方面的優(yōu)化少有涉及[14]。同時(shí),馬鈴薯醋多為運(yùn)用酵母菌和醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵而成。目前,國內(nèi)關(guān)于利用紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的研究尚未報(bào)道。人們對(duì)紅茶菌作用機(jī)理的研究寥寥無幾,且紅茶菌功能性食品品種極少,市場化程度低[15]。
本研究以馬鈴薯(青薯9號(hào))為原料,利用紅茶菌進(jìn)行馬鈴薯醋發(fā)酵,并以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為響應(yīng)值,初始糖度、紅茶菌接種量及發(fā)酵溫度為考察因素,采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鈴薯醋發(fā)酵工藝。加深對(duì)紅茶菌的研究,拓寬馬鈴薯加工渠道,發(fā)展馬鈴薯加工業(yè),實(shí)現(xiàn)增值。
1.1.1 材料與菌株
馬鈴薯(青薯9號(hào)):寧夏黃土地農(nóng)業(yè)食品有限公司提供(淀粉含量15.1%,粗蛋白含量2.08%,維生素C含量18.6 mg/100 g鮮薯)[16];紅茶菌:寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
1.1.2 試劑
α-淀粉酶(≥3 700 U/g)、糖化酶(≥10 000 U/g):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;紅茶、白砂糖、檸檬酸(均為食用級(jí)):市售。
HH.S21-6型電熱恒溫水浴鍋、BSP-250型生化培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PB-10型酸度計(jì):北京賽多利斯公司;WYT-4型手持糖度計(jì):泉州中友光學(xué)儀器有限公司;T-1000型電子天平:美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;H-1650型臺(tái)式高速離心機(jī):上海趙迪生物科技有限公司。
1.3.1 紅茶菌的活化與培養(yǎng)
按照糖∶紅茶∶水為1∶15∶100的比例[17],將紅茶加入沸水中,于85~90℃保持25 min,過濾得茶汁,加入溶化的糖水,接入40%紅茶菌種母液,放入玻璃容器中,用單層紗布封口,于30℃靜置發(fā)酵7 d,待液面產(chǎn)生數(shù)層菌膜即可。
用消毒后的鑷子取出容器內(nèi)殘余的菌膜,去除菌膜上褐變的部分,用無菌水沖洗菌膜數(shù)遍。無菌水洗凈容器后,倒入成熟的紅茶菌菌液和新鮮的紅茶糖水及處理好的紅茶菌菌膜,再按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)紅茶菌,直至擴(kuò)大培養(yǎng)到所需用量。
1.3.2 馬鈴薯醋工藝流程及操作要點(diǎn)
馬鈴薯預(yù)處理→蒸煮→打漿→酶解→滅酶→過濾→調(diào)糖、調(diào)酸→高溫滅菌→接紅茶菌→紅茶菌發(fā)酵→陳釀→過濾→灌裝→滅菌→成品
(1)原料預(yù)處理、蒸煮、打漿[18]:將馬鈴薯進(jìn)行清洗、去皮、切分,蒸熟晾涼后,加入馬鈴薯質(zhì)量4倍的水進(jìn)行打漿,制成馬鈴薯原液。
(2)酶解、滅酶、過濾:在馬鈴薯原液中加入0.23%α-淀粉酶、0.23%糖化酶,在60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行液化、糖化4 h,90℃水浴10 min,滅酶并過濾,制成馬鈴薯糖化液。
(3)調(diào)糖、調(diào)酸:在馬鈴薯糖化液中加入白砂糖、檸檬酸,將糖度調(diào)至18.0%,pH調(diào)至3.80。
(4)高溫滅菌:馬鈴薯糖化液在121℃條件下高壓滅菌15 min,冷卻待用。
(5)紅茶菌接種與發(fā)酵:將冷卻后的馬鈴薯糖化液接入活化后的紅茶菌中,放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行紅茶菌發(fā)酵,測定總酸含量接近2.5 g/100 mL后結(jié)束發(fā)酵。
(6)陳釀、過濾:將發(fā)酵結(jié)束的原醋陳釀60 d,離心、過濾制得馬鈴薯醋。
(7)灌裝、滅菌:選擇合適的包裝瓶,將馬鈴薯醋液灌裝進(jìn)去,封好進(jìn)行巴氏殺菌。
1.3.3 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)
初始糖度:馬鈴薯糖化液過濾后,分別加白砂糖調(diào)糖度至12.0%、14.0%、16.0%、18.0%、20.0%,接入20%培養(yǎng)好的紅茶菌液,于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵,測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。
紅茶菌接種量:馬鈴薯糖化液過濾后,調(diào)糖度至20%,分別接入5%、10%、15%、20%、25%紅茶菌液,在30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵,測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。
發(fā)酵溫度:馬鈴薯糖化液過濾后,調(diào)糖度至20%,接入20%紅茶菌液,分別于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵,測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。
1.3.4 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以陳釀前馬鈴薯醋中的總酸含量(Y)為響應(yīng)值,考察初始糖度(A)、紅茶菌接種量(B)及發(fā)酵溫度(C)3個(gè)因素對(duì)馬鈴薯醋發(fā)酵的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。
表1 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for potato vinegar fermentation process optimization
1.3.5 分析方法
總酸含量(以醋酸計(jì))的測定:酚酞指示劑法[19];糖度的測定(以葡萄糖計(jì)):3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法[20];感官指標(biāo)的測定:參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》;細(xì)菌總數(shù)的測定:參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》;大腸菌群的測定:參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》;致病菌的測定:GB/T 4789.22—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)調(diào)味品檢驗(yàn)》;可溶性固形物含量的測定:參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》。
2.1.1 初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響
初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖1。
圖1 初始糖度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on total acid content in potato vinegar before aging
由圖1可以看出,在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),隨著初始糖度的增大,陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)初始糖度為18.0%時(shí),陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高,為2.34 g/100 mL。因此,確定最佳初始糖度為18.0%。
2.1.2 紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響
紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖2。
圖2 紅茶菌接種量對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.2 Effect of kombucha inoculum on total acid content in potato vinegar before aging
由圖2可以看出,在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi),隨著紅茶菌接種量的增大,陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。當(dāng)紅茶菌接種量為20%時(shí),陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高,為2.32 g/100 mL。因此,確定紅茶菌最佳接種量為20%。
2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響
發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結(jié)果見圖3。
圖3 發(fā)酵溫度對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on total acid content in potato vinegar before aging
由圖3可以看出,在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),發(fā)酵溫度在28~36℃的范圍內(nèi),陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí),陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高,為2.33 g/100 mL。因此,確定最佳發(fā)酵溫度為32℃。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量(Y)為響應(yīng)值,利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察初始糖度(A)、紅茶菌接種量(B)及發(fā)酵溫度(C)3個(gè)因素對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響,結(jié)果與分析見表2,方差分析見表3。
表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken tests
續(xù)表
表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation
通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合,得到總酸含量(Y)與初始糖度(A)、紅茶菌接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)的回歸方程:
由表3可知,模型P<0.000 1,極顯著;失擬項(xiàng)P>0.05,不顯著,表明回歸模型的擬合度較好,可以用該方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。各因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锳>C>B,即初始糖度>發(fā)酵溫度>紅茶菌接種量。由方差分析可知,因素一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)結(jié)果影響不顯著(P>0.05)。
通過軟件繪制響應(yīng)面圖進(jìn)行可視化分析,初始糖度、紅茶菌接種量、發(fā)酵溫度間交互作用的響應(yīng)面和等高線見圖4。由圖4可知,拋物面開口均向下,有極大值點(diǎn);等高線均呈圓形,表明交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著,與方差分析結(jié)果一致。
圖4 各因素交互作用對(duì)陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on total acid content in potato vinegar before aging
運(yùn)行軟件的期望函數(shù)優(yōu)化程序,以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量達(dá)到最大值為目標(biāo),獲得優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為初始糖度18.62%、紅茶菌接種量20.56%、發(fā)酵溫度33.65℃,預(yù)測總酸含量可達(dá)到2.55 g/100 mL??紤]到實(shí)際操作的局限性,將最優(yōu)發(fā)酵條件調(diào)整為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃,在該條件下重復(fù)試驗(yàn)5次,獲得陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL,與預(yù)測值基本符合,充分證明了該模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。綜上所述,紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃。
2.3.1 感官指標(biāo)
色澤:淺黃色;香氣:醇香,醋香香味協(xié)調(diào);味道:酸中帶甜,無不良?xì)馕?;體態(tài):澄清透亮,無沉淀,無浮膜。
2.3.2 理化指標(biāo)
馬鈴薯醋陳釀后總酸含量(以乙酸計(jì))為3.60 g/100 mL;可溶性固形物含量為10.50%,符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18187—2000《釀造食醋》具體要求。
2.3.3 微生物指標(biāo)
細(xì)菌總數(shù)≤500 CFU/mL;大腸桿菌未檢出;其他致病菌未檢出。符合GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》具體要求。
以新鮮馬鈴薯(青薯9號(hào))為原料,利用紅茶菌中豐富的酵母菌、醋酸菌、乳酸菌組成的共生菌系對(duì)馬鈴薯糖化汁進(jìn)行發(fā)酵,制備馬鈴薯醋。馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵液初始糖度19%,紅茶菌接種量21%,發(fā)酵溫度34℃。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下,陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL,較優(yōu)化前提高20.4%。經(jīng)陳釀后總酸可達(dá)3.60 g/100 mL,馬鈴薯醋澄清透亮,無沉淀,無浮膜;呈淺黃色;醋香香味協(xié)調(diào);酸中帶甜,無不良?xì)馕丁N⑸镏笜?biāo)和理化指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。