海南廣藿香內(nèi)生真菌分離鑒定及拮抗菌株篩選

易天鳳 吳友根 于靖 張軍鋒 楊東梅

摘 ?要 ?本研究從海南廣藿香的根、莖、葉和花等組織中分離獲得61株內(nèi)生真菌，采用顯微形態(tài)觀察和ITS序列分析鑒定為15個屬，其中優(yōu)勢菌群為炭疽菌屬（Colletotrichum）和干酪酵母菌屬（Meyerozyma）。以澳洲堅(jiān)果葉枯病菌（Pestalotiopsis microspora）、西瓜枯萎病菌（Fusarium?oxysporum）和火龍果潰瘍病菌（Neoscytalidium dimi dia tum）為指示菌，采用平板對峙法進(jìn)行拮抗菌株篩選，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬（Fusarium）菌株P(guān)fuJ20、PfuG16和PfuG5對澳洲堅(jiān)果葉枯病菌的抑制效果最好，棒孢屬（Corynespora）菌株P(guān)fuH2對西瓜枯萎病菌抑菌效果較好。采用濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行各菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌等動植物病原細(xì)菌的抑菌作用評價(jià)，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬PfuJ20、PfuG16對各細(xì)菌均有較強(qiáng)抑制效果，而鏈格孢屬（Alternaria） PfuH1對金黃色葡萄球菌的生長抑制效果相對最強(qiáng)。結(jié)果表明，海南廣藿香內(nèi)生真菌具有一定的生物多樣性，部分內(nèi)生真菌菌株具有較強(qiáng)的抑菌活性。

關(guān)鍵詞 ?廣藿香;內(nèi)生真菌;拮抗菌株

中圖分類號 ?S476 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?In this study， 61 endophytic fungi were isolated from roots， stems， leaves and flowers of Hainan patchouli， and identified as 15 genera by ITS sequence analysis and morphological analysis. The dominant genus was the Colletotrichum and Meyerozyma. The inhibitory effect of Fusarium PfuJ20， PfuG16 and PfuG5 on Pestalotiopsis microspora was most obvious when Pestalotiopsis microspora， Fusarium oxysporum and Neoscytalidium dimidiatum were used as the indicator bacteria， and the activity of phytopathogenic fungi was determined by the plate sputum method. The activity of anti-phytopathogenic bacteria was determined by the filter paper diffusion method. Fusarium had strong inhibitory effects on the growth of Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Salmonella and Bacillus subtilis and Alternaria had the strongest growth inhibitory effect on Staphylococcus aureus. The results showed that Hainan patchouli endophytic fungi had certain biodiversity and some endophytic fungal strains had more obvious antibacterial activity.

Keywords ?Pogostemon cablin; endophytic fungi; antagonistic strains

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.021

廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco.） Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，如馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞等國，在我國引種可追溯到梁代或以前[1]。現(xiàn)主要分布于廣東和海南2省，廣東廣州、肇慶、湛江以及海南萬寧等地均有栽培?，F(xiàn)今廣藿香按產(chǎn)地可分為“廣州石牌廣藿香”（牌香）、“廣東高要廣藿香”（肇香）、“廣東湛江廣藿香”（湛香）和“海南廣藿香”（南香）4種[2-3]。自古以來廣藿香已廣泛用作藥材，在藥用生產(chǎn)應(yīng)用上有很大的前景，他具有芳香化濁、止嘔及發(fā)表解暑之功效，常用于胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛等方面疾病的治療?，F(xiàn)代研究表明廣藿香具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲等作用[4]，從廣藿香中提取的精油在輕化工業(yè)上是重要的原料，可應(yīng)用于化妝品、香水等的制作[5-6]。

植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，部分菌株具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、抗病蟲害、抗逆境、促植物生長等作用[7]。目前，關(guān)于廣藿香的報(bào)道多數(shù)集中在活性成分的研究上，包括Daldinia eschscholtzii、Cerrena sp. A593、Diaporthe longicolla A616和Bipolaris sorokiniana A606等內(nèi)生真菌的活性成分已得到初步研究[8-11]，但有關(guān)內(nèi)生真菌在其與宿主植物組成的微生態(tài)系統(tǒng)中的作用機(jī)制還缺少研究。本研究選用海南廣藿香（南香）作為研究材料，開展了內(nèi)生真菌的分離鑒定及拮抗菌株篩選活動，為進(jìn)一步開展相關(guān)內(nèi)生真菌資源的收集與利用提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?廣藿香品種為南香，由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供，2017年2月種植于海南省儋州市（N20336，E1101925），常規(guī)管理，2018年5月取樣。

1.1.2 ?培養(yǎng)基和試劑 ?孟加拉紅平板培養(yǎng)基（用于分離內(nèi)生真菌）、PDA固體培養(yǎng)基（用于保存內(nèi)生真菌）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）液體培養(yǎng)基（用于內(nèi)生真菌發(fā)酵）、營養(yǎng)瓊脂（NA）固體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)指示細(xì)菌），購自北京索萊寶Solarbio科技有限公司。真菌基因組DNA提取試劑盒、PCR 相關(guān)試劑等購買于北京索萊寶科技有限公司。引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（測序引物為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATT MGA TA TGC-3′和ITS1f：5′-CTTGGTCATTTAGA GG AAG TAA-3′）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 ?供試菌株 ?真菌：澳洲堅(jiān)果葉枯病菌，擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）;西瓜枯萎病，尖胞鐮刀菌（西瓜專化型）（Fusarium oxysporum）;火龍果潰瘍病，新暗色柱節(jié)孢菌（Neo scyt alidium dim dia tum）。細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Sta phylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌 、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。供試菌株均由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?海南廣藿香內(nèi)生真菌分離鑒定 ?參照馬文婷等[12]的方法進(jìn)行內(nèi)生真菌分離。

顯微形態(tài)觀察：菌株接種培養(yǎng)基平板后，將蓋玻片45～50插入固體培養(yǎng)基，待菌絲擴(kuò)展至蓋玻片處時取下，滴加棉蘭染色劑，放在載玻片上用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

ITS序列分析：參照說明書用試劑盒提取各真菌菌株的基因組DNA，基于核糖體ITS區(qū)域的序列分析鑒定內(nèi)生真菌[12]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 ?內(nèi)生真菌對植物病原真菌的拮抗作用評價(jià) ?平板對峙法參照張冬靜[13]的方法進(jìn)行篩選。抑菌活性測試公式：

生長抑制率=（1-r/r0）100%式中，r為處理組病原菌生長半徑;r0為對照組病原真菌生長半徑。

1.2.3 ?內(nèi)生真菌對動植物病原細(xì)菌的拮抗作用評價(jià) ?發(fā)酵物制備：挑取5個純化的內(nèi)生真菌菌餅接入裝有PDB培養(yǎng)基此處應(yīng)補(bǔ)充說明培養(yǎng)基的體積（121?℃、20?min滅菌）的250 mL錐形瓶中，放入搖床25?℃恒溫黑暗培養(yǎng)7?d左右。發(fā)酵液經(jīng)兩層濾紙片過濾，分別收集菌液與菌絲體，將乙酸乙酯加入菌液（1∶1，V/V）與干燥后粉碎的菌絲體，充分混勻后存放1?d，同樣過程將菌液與菌絲體萃取3次收集有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，加甲醇配至20?mg/mL溶液，得到提取液。

抑菌測試：將濃度為（1105～1 107）CFU/mL的指示菌懸液均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基平板表面，再將浸泡于提取液24 h的濾紙片放置在平板表面，3次重復(fù)，以甲醇溶液為對照，37?℃恒溫培養(yǎng)1 d后測量抑菌圈直徑。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，SAS 8.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果及分析

2.1 ?海南廣藿香內(nèi)生真菌分離結(jié)果

通過平板分離法對廣藿香內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，采用漂洗液和組織印記法檢測表面消毒情況顯示對照組無明顯菌落長出。表明試驗(yàn)材料表面已消毒徹底，分離獲得的菌株來自海南廣藿香組織內(nèi)部。從海南廣藿香中總共分離出61株內(nèi)生真菌，其中根部分離出14株，莖、葉、花分別分離出20、19、8株（表1）。代表性的海南廣藿香內(nèi)生真菌形態(tài)特征如表2所示。

2.2 ?海南廣藿香內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果分析

將分離得到的廣藿香內(nèi)生真菌進(jìn)行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增序列條帶在600 bp左右。部分海南廣藿香內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列的相似性分析結(jié)果如表3所示，所獲菌株序列長度在500 bp左右，且與同源菌株一致性都在90%以上。部分顯微形態(tài)觀察如圖1：PfuG16菌絲有隔，分枝，分生孢子呈紡錘形，可初步判斷為鐮刀菌屬;PfuH1分生孢子呈暗色的鏈狀，且有明顯的隔，則可鑒定為鏈格孢屬;PfuH8分生孢子器球形，分生孢子單生于梗的末端呈橢圓形，可鑒定為莖點(diǎn)霉屬。

本研究通過顯微形態(tài)觀察及分子鑒定的方法，分析出61株內(nèi)生真菌為15個屬，主要有炭疽菌屬Colletotrichum、子囊菌屬Ascomycota、棒孢屬Corynespora、間座殼屬Diaporthe、鐮刀菌屬Fusarium、從孢菌屬Arthrobotrys等，表明海南廣藿香內(nèi)生真菌具有一定的生物多樣性。通過對海南廣藿香不同部位內(nèi)生真菌的分離，發(fā)現(xiàn)不同組織部位的內(nèi)生真菌種屬分布不同，同一菌屬也可存活在不同組織。炭疽菌屬Colletotr ichum、棒孢屬Corynespora在根、莖、葉、花中都有分布;鏈格孢屬Alternaria、莖點(diǎn)霉屬Phoma和枝孢霉屬Cladosporium僅在花部分布;曲霉屬Aspergillus僅分布于葉部;分離到的Plectos phaerella sp.、Terfezia sp.、Mycoleptodiscus sp.和Ophiostomatales sp.只分布于莖部。結(jié)果表明，海南廣藿香不同部位分離的內(nèi)生真菌種屬存在差異，其中優(yōu)勢菌屬為炭疽菌屬（比例=21.31%）和Meyerozyma sp.（比例=27.87%）。

2.3 ?拮抗性內(nèi)生真菌篩選

2.3.1 ?內(nèi)生真菌對植物病原真菌的拮抗作用評價(jià)經(jīng)拮抗作用評價(jià)后，得到15株對靶標(biāo)病原真菌具有抑制效果的菌株（表4）。該15株內(nèi)生真菌對P. microspore生長均有抑制作用，抑菌率都在30%以上，其中鐮刀菌屬的PfuJ20、PfuG16和PfuG5的抑菌效果最為顯著，抑菌率均在80%以上;如圖2可見，PfuL20拮抗P. microspora、PfuJ20拮抗P. microspora效果明顯。子囊菌PfuJ3、棒孢屬PfuH2、莖點(diǎn)霉屬PfuH8和炭疽菌屬PfuH5對F. oxysporum有較好的抑菌作用，抑菌率為50%以上，而內(nèi)生真菌中僅莖點(diǎn)霉屬PfuH8對N. dimidiatum有較好的抑菌作用（抑菌率為54.5%）。

2.3.2 ?抗動植物病原細(xì)菌活性結(jié)果分析 ?經(jīng)過初篩得到10株對病原菌抑制效果明顯的內(nèi)生真菌，包含了8個屬。由表5可知，抗S. aureus的菌株有8株，分別是PfuG8、PfuJ19、PfuH4、PfuG17、PfuG7、PfuL11、PfuJ6、PfuH1，占分離菌株總數(shù)的13.1%;抗E. coli的菌株有7株，分別是PfuG8、PfuJ3、PfuH4、PfuG17、PfuL11、PfuJ6、PfuH1，占分離菌株總數(shù)的11.4%;抗B. subtilis的菌株有4株，分別是PfuG8、PfuH4、PfuG17、PfuH1，占分離菌株總數(shù)的6.5%;抗S. enteritidis的菌株有5株，分別是PfuG8、PfuJ3、PfuL15、PfuG17、PfuH1，占分離菌株總數(shù)的8.2%;分別鑒定為鐮刀菌屬Fusarium與鏈格孢屬Alternaria的PfuG17和PfuH1對供試菌株的生長抑制最為顯著：PfuG17對供試細(xì)菌的抑菌圈直徑可達(dá)到15 mm以上;H1對供試細(xì)菌的抑菌圈直徑也可達(dá)11 mm以上，尤其對金黃色葡萄球菌（S. aureus）的抑制圈直徑高達(dá)24 mm。圖3為PfuH1和PfuG17菌株對病原細(xì)菌的拮抗作用，表明該菌株有明顯的抗菌效果。

3 ?討論

相關(guān)研究表明，內(nèi)生真菌是普遍存在于植物組織內(nèi)，且表現(xiàn)出多樣性，大多數(shù)植物內(nèi)生菌在植物不同的組織和器官內(nèi)均有分布，而且它們的分布情況由宿主植物本身以及內(nèi)生菌的種類所決定，在宿主植物不同器官的分布存在差異[14-15]。本研究在海南廣藿香不同組織分離鑒定得到61株內(nèi)生真菌，鑒定為15個屬，且不同組織的分布存在差異，可能和不同組織提供的生長條件不同所造成的，吳婧波從杧果組織中分離得到53株內(nèi)生真菌，其中膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、杧果球座菌（Guignardia mangiferae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）為優(yōu)勢種，且各屬在組織中分布也存在差異[16]。炭疽菌屬內(nèi)生真菌在藥用草本植物中廣泛分布[17]，其在海南廣藿香組織中同樣屬于優(yōu)勢菌屬。謝華蓉的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)廣藿香內(nèi)生真菌炭疽菌屬（11.82%）為優(yōu)勢類群，鏈格孢屬（占28.75%）、擬莖點(diǎn)霉屬（占23.00%）的比例也高，存在這種差異可能是由于樣品品種和環(huán)境條件的差異所造成的[18]。

內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，其具有抗病原微生物的作用。本研究通過抑菌測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬對澳洲堅(jiān)果葉枯?。〝M盤多毛孢）的生長抑制率高達(dá)80%，鐮刀菌屬在植物內(nèi)生真菌中很常見，不少研究也發(fā)現(xiàn)該屬產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對病原菌有一定的抑制作用。在廣藿香中分離的內(nèi)生真菌對荔枝霜疫霉霉（Peronop htho ra litchic）的抑制率高達(dá)95%，其中鐮刀菌屬抑制效果突出[19]，其提取物濃度為50?g/L，試驗(yàn)結(jié)果差異說明抑菌效果與提取物濃度有密切關(guān)系。在進(jìn)行海南廣藿香內(nèi)生真菌抑菌性測試時發(fā)現(xiàn)莖點(diǎn)霉屬對澳洲堅(jiān)果葉枯病的生長抑制顯著，科研人員在進(jìn)行該屬內(nèi)生真菌相關(guān)試驗(yàn)時也發(fā)現(xiàn)：從薄荷 （Mentha haplocalyx Briq.?）中分離到的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌能產(chǎn)生一種具有臨床應(yīng)用前景的新抗生素dicera ndorls[20];而且從銀杏中分離的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌中提取的杜松烷倍半萜也具有較強(qiáng)的抗菌作用[21]。這為海南廣藿香擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)研究提供了方向。在海南廣藿香中分離得到的鏈格孢屬對金黃色葡萄球菌也有顯著的生長抑制效果，馮成亮等[22]從無花果中分離的鏈格孢屬內(nèi)生真菌可分離出對Valsa mali生長有明顯抑制作用的次生代謝產(chǎn)物。由此可見，本研究對下一步內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

當(dāng)今已經(jīng)有大量的研究工作者對內(nèi)生真菌活性成分進(jìn)行深入探索，此次研究在國內(nèi)首次對廣藿香花的內(nèi)生真菌進(jìn)行探索，研究結(jié)果表明，廣藿香內(nèi)生真菌在組織內(nèi)表現(xiàn)出多樣性，且從廣藿香中分離的內(nèi)生真菌部分具有較強(qiáng)抑菌活性，因此研究廣藿香內(nèi)生真菌的抑菌性為開發(fā)有效化合物及廣藿香資源利用提供了理論依據(jù)，對于工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

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