高茜，楊斌，管瑩，畢品端，黃海濤，曾婉俐，向海英，劉欣，米其利，李雪梅*

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南省昆明市高新區(qū)科醫(yī)路41號，650024;

2 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南省昆明市西昌路295號，650032

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性、易復(fù)發(fā)的消化系統(tǒng)疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）[1]。由于飲食結(jié)構(gòu)的變化，IBD在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷升高趨勢[2]。目前，IBD尚無有效的根治手段，但多數(shù)患者可通過藥物治療使病情得到有效緩解。煙堿，俗名尼古丁，是一種從茄科植物（茄屬）中提取出的三級胺生物堿，也是煙草的重要成分[3]，已被用作潰瘍性結(jié)腸炎患者的治療劑[4]。咀嚼尼古丁口香糖可有效控制輕度至中度結(jié)腸炎的臨床病癥[5]。盡管如此，尼古丁的作用機(jī)制尚不清楚。

自噬是一種特殊的細(xì)胞內(nèi)吞噬現(xiàn)象，能夠主動吞噬細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物，降解成氨基酸、核糖等代謝物重新用于生物合成和供能，進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[6]。在消化系統(tǒng)疾病最常發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）中，自噬通過消化蛋白聚集物和錯誤折疊蛋白維護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，限制ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)消化道細(xì)胞[7]。研究證實(shí)自噬是消化道炎癥反應(yīng)的一個重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。一項(xiàng)GWAS分析顯示自噬基因ATG16L1的多態(tài)性位點(diǎn)與IBD的發(fā)病率存在相關(guān)性[8]。這些證據(jù)說明自噬在消化系統(tǒng)疾病中扮演重要角色。本研究的主要目的是觀測尼古丁對上皮細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制，了解該機(jī)制將有助于為IBD的治療和預(yù)防帶來新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、lipofectamine 2000均購自美國Thermo公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo，日本）；預(yù)染蛋白Marker（Thermo公司，美國），兔抗人LC3、Beclin1、p62、β-actin抗體（SantaCruz公司，美國）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司，美國），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（碧云天公司，江蘇）

酶標(biāo)儀（Tecan，Mannedorf，Switzerland），電泳及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），Odyssey掃描儀（LiCor公司，美國），分光光度計(jì)（Jenway公司，英國），熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和條件

1.2.1 人腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人腸道上皮細(xì)胞（Hunman intestinal epithelial cells，hIECs）來源于中國科學(xué)院昆明動物研究所。使用含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天常規(guī)換液，待細(xì)胞增殖至板底面積90%時胰酶消化傳代，第4代hIECs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖情況

使用CCK8試劑盒并根據(jù)使用說明測定細(xì)胞活力。將hIECs在96孔板中培養(yǎng)以達(dá)到所需的匯合。將細(xì)胞與不同濃度的尼古?。?、2.5、5和10 μM）一起孵育。在尼古丁處理24小時后，向每個孔中加入10 μlCCK-8溶液。再將細(xì)胞在37℃下孵育2小時。使用酶標(biāo)儀（Tecan，Mannedorf，Switzerland）在450nm處讀取吸光度。

1.2.3 Western-blot檢測自噬標(biāo)志蛋白和mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取生長狀態(tài)良好的hIECs，以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種于六孔板中，待細(xì)胞生長至80%后分別給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h，PBS洗滌后每孔加入120 μL含1 mM蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（ridio-immunoprecipition assay，RIPA），在冰上充分裂解后刮取細(xì)胞。將細(xì)胞裂解混合物移至EP管中，4 ℃、12 000 r離心15 min。收集上清，采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔進(jìn)樣總蛋白30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。電泳分離蛋白后，采用恒流200 mA的濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h后，孵育一抗（LC3B，1:300稀釋；Beclin1，1:500稀釋；p62，1:500稀釋；β-actin，1:1000稀釋），4 ℃過夜。室溫孵育二抗2 h后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算LC3BII、Beclin1、p62與內(nèi)參的灰度值的比值，得出各個蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察hIECs內(nèi)自噬體的形成情況

取生長狀態(tài)良好的hIECs，制備成密度為2×105個/mL細(xì)胞懸液，取2 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至80%后，實(shí)驗(yàn)組給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h，胰蛋白酶消化后制成密度為1×106個/mL細(xì)胞懸液，4℃、1 200 r離心5 min后棄上清，加入1 mL預(yù)冷2.5%戊二醛固定，4℃過夜，根據(jù)文獻(xiàn)[13]的操作步驟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.5 GFP-LC3自噬斑點(diǎn)檢測

取生長狀態(tài)良好的hIECs，以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長至80%時，使用lipofectamine 2000將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，再給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h。使用倒置熒光顯微鏡（Olympus FV1000，Tokyo，Japan）進(jìn)行圖像采集。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁對細(xì)胞形態(tài)的影響

人腸道上皮細(xì)胞hIECs在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)，并且單層細(xì)胞為貼壁生長的，細(xì)胞核較大，而細(xì)胞質(zhì)相對較少。2.5 μM尼古丁處理的細(xì)胞的形態(tài)更傾向于正常細(xì)胞形態(tài)，僅有少部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化。而10 μM尼古丁作用細(xì)胞后，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞體積變小、形狀變圓，脫壁細(xì)胞越來越多，但是它的細(xì)胞膜突起反而變少（圖1）。

圖1 不同濃度尼古丁對于結(jié)腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of nicotine on hIEC morphology

2.2 尼古丁對細(xì)胞增殖的影響

進(jìn)一步采用CCK8法檢測尼古丁對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著尼古丁濃度的增加，人腸道上皮細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。2.5 μM尼古丁對細(xì)胞增殖抑制程度較低；而5 μM和10 μM尼古丁顯著抑制細(xì)胞增殖（圖2）。

圖2 不同濃度尼古丁對于結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of difference concentrations of nicotine on hIEC proliferation

圖3 尼古丁對自噬標(biāo)志物表達(dá)水平的影響Fig.3 The expression of LC3B-II,p62 and Beclin1 protein in hIEC treated with nicotine

2.3 尼古丁對細(xì)胞中自噬標(biāo)志物的影響

Western blot結(jié)果如圖3A所示：尼古丁作用24h后，與空白對照組相比，Beclin1和LC3B-II表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且這一升高趨勢呈現(xiàn)濃度依賴（圖3B和圖3D）。p62在正常細(xì)胞中高表達(dá)，不同濃度的尼古丁處理后，其表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖3C）。這說明尼古丁能夠引起自噬標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平的改變。

2.4 尼古丁作用后細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成以及數(shù)量變化

不同濃度的尼古丁作用細(xì)胞24 h后行TEM觀察。與未處理組相比，尼古丁處理后細(xì)胞出現(xiàn)多個雙層的自噬泡，并形成自噬小體（黑色箭頭示）。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，尼古丁處理后細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量明顯增高，但不同濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。

圖4 尼古丁誘導(dǎo)的電鏡下自噬小體的數(shù)量變化Fig.4 The change of number of autophagosomes in hIECs treated with nicotine by TEM

2.5 尼古丁對GFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中自噬斑點(diǎn)的影響

將GFP-LC3轉(zhuǎn)染至待測細(xì)胞，并通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀測、定量GFP-LC3的熒光亮點(diǎn)，是目前應(yīng)用較為廣泛的哺乳動物細(xì)胞自噬檢測技術(shù)。本研究利用該技術(shù)手段對尼古丁誘導(dǎo)的自噬進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未處理的細(xì)胞中綠色，熒光亮點(diǎn)數(shù)量均很低，而隨著尼古丁處理濃度的增加，細(xì)胞中綠色熒光亮點(diǎn)數(shù)量顯著增加，但不同濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）。

圖5 尼古丁誘導(dǎo)的GFP-LC3自噬斑點(diǎn)的數(shù)量變化Fig.5 The change of number of nicotine-induced spots of LC3 in hIECs by GFP-LC3 assay

2.6 尼古丁誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制

已有的文獻(xiàn)推測尼古丁誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制，一方面可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，另一方面可能與mTOR信號通路相關(guān)。采用western blot方法，對這兩條信號通路上的關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖6所示，尼古丁可以增加ERS關(guān)鍵因子GRP78，以及下游信號通路中ATF/IRE1的表達(dá)水平。同時，尼古丁能夠激活A(yù)MPK蛋白的磷酸化，并抑制Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，誘導(dǎo)自噬。

圖6 尼古丁誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制：激活 ERS和抑制mTOR信號通路Fig.6 Molecular mechanisms of nicotine-induced autophagy:activation of ERS and inhibition of mTOR signaling pathways

3 討論

炎癥性腸?。↖BD）是由易感基因，環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間一系列復(fù)雜的相互作用所導(dǎo)致的[9]。功能失調(diào)的自噬被認(rèn)為是許多慢性炎性疾病的發(fā)病因素，包括炎癥性腸?。↖BD）。自噬在IBD發(fā)病機(jī)制中起多重作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)采用2.5 μM的尼古丁處理細(xì)胞，能夠成功誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。Marjolaine等[10]的研究中，他們采用100 nM的尼古丁誘導(dǎo)2 h同樣成功誘導(dǎo)自噬，但并未誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生較高水平凋亡，這暗示低濃度的尼古丁對細(xì)胞的保護(hù)作用很可能是通過自噬來調(diào)控。在本研究中，低濃度劑量（2.5 μM）的尼古丁對于細(xì)胞的增殖無明顯的抑制作用；而當(dāng)劑量達(dá)到或超過5 μM時，會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此，實(shí)驗(yàn)采用低劑量（2.5 μM）尼古丁刺激細(xì)胞，成功誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)。在2.5 μM尼古丁的作用下，hIECs的細(xì)胞自噬標(biāo)志物Beclin1和LC3B-II蛋白表達(dá)顯著升高，p62明顯受到抑制。Beclin1存在于反面高爾基網(wǎng)上面，它是酵母Atg6基因在哺乳動物中的同源類似物，與自噬前體結(jié)合后啟動自噬體的形成，因此為開啟自噬所必須[11]。LC3B存在兩種形式，LC3B-I和他的水解衍生物L(fēng)C3B-II。其分別位于細(xì)胞質(zhì)和自噬體的胞膜。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，LC3B-I就會被水解為LC3B-II。因此，LC3B-II常被用作自噬評估的公認(rèn)指標(biāo)。p62與LC3偶聯(lián)在一起，可以當(dāng)作調(diào)節(jié)因子的一種，作用于自噬體的形成，但是它在自噬過程的中、晚期的時候被降解，也常作為追蹤自噬的指標(biāo)[12]。因此，通過了解上述自噬標(biāo)志物的表達(dá)水平，可對細(xì)胞的自吞噬活性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和判斷。此外，本研究還通過TEM從組織學(xué)水平證實(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬體的形態(tài)及數(shù)量變化同樣受尼古丁作用的影響。這些結(jié)果均為本研究中低濃度尼古丁誘導(dǎo)自噬提供了證據(jù)。

目前，臨床上廣泛使用的IBD治療劑與自噬均密切相關(guān)，包括類固醇、5-氨基水楊酸、硫銼嘌呤等[7]，均能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。而本研究在人腸道上皮細(xì)胞中同樣證實(shí)尼古丁同自噬密切相關(guān)。這同目前UC臨床上對尼古丁的使用相一致。研究普遍認(rèn)為吸煙可以提供對UC患者的保護(hù)[13]。一項(xiàng)薈萃分析證實(shí)，與非吸煙的人群相比，吸煙人群患UC的風(fēng)險顯著降低[OR 0.58（0.45-0.75）][14]。此外，吸煙的UC患者的住院率、復(fù)發(fā)率和結(jié)腸切除手術(shù)率較非吸煙的UC患者均顯著降低[15]。雖然吸煙的影響與尼古丁的影響不盡相同，但有臨床證據(jù)表明，尼古丁和/或其代謝產(chǎn)物（如可替寧）是活動性UC患者從吸煙中獲益的主要原因。尼古丁在人體內(nèi)的半衰期約為2小時，而可替寧是尼古丁代謝的副產(chǎn)物，可在血液中存留48小時。尼古丁起效快，代謝產(chǎn)物存留時間長，且血漿蛋白結(jié)合率小于5%，合并用藥對于藥代動力學(xué)影響甚微[16]。因此，充分了解尼古丁在UC中的機(jī)制將為IBD的治療和預(yù)防帶來新的策略。

本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步檢測尼古丁誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制。腸道上皮細(xì)胞極易受到ERS影響，其結(jié)果是自噬的激活以及自噬通量的增加[17,18]。已有的研究證實(shí)尼古丁與ERS密切相關(guān)。Wong等[19]發(fā)現(xiàn)尼古丁能直接誘導(dǎo)ERS，上調(diào)ERS標(biāo)志物PERK、eif2a等表達(dá)或磷酸化修飾。本研究也顯示尼古丁上調(diào)GRP78/BIP的表達(dá)水平，啟動ERS，這可能是尼古丁誘導(dǎo)自噬的一個機(jī)制。mTOR激酶是誘導(dǎo)自噬的重要調(diào)節(jié)分子，mTOR信號通路能夠同體內(nèi)微環(huán)境協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和存活[20]。多項(xiàng)研究表明，mTOR介導(dǎo)的自噬在IBD過程中扮演重要角色[20-22]。一方面，上游Akt和 MAPK信號通路能夠激活 mTOR抑制自噬；另一方面，AMPK和 p53信號通路能夠負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR促進(jìn)自噬[23]。對AMPK、Akt介導(dǎo)的mTOR信號通路進(jìn)行的檢測結(jié)果顯示尼古丁能夠增加AMPK的磷酸化水平，降低Akt的磷酸化水平，最終導(dǎo)致mTOR受到抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。此外，Akt/mTOR也是細(xì)胞凋亡的重要通路[24]。這可能與高濃度尼古丁促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)。因此，尼古丁在UC的治療作用很可能取決于使用濃度。

綜上所述，自噬在UC的治療中起著重要作用，自噬調(diào)節(jié)類藥物作為IBD的潛在治療靶點(diǎn)會受到越來越多的關(guān)注。低濃度尼古丁能夠誘導(dǎo)自噬，與ERS和mTOR信號通路密切相關(guān)，進(jìn)一步對該分子機(jī)制進(jìn)行研究，有助于開發(fā)調(diào)節(jié)自噬治療UC的新治療靶點(diǎn)。