辛穎 王樹水

1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院（廣東汕頭515000）；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所心兒科（廣州510080）

遺傳綜合征大多屬于疑難罕見病，表型復(fù)雜，臨床診斷困難，由于人們對(duì)這類疾病認(rèn)識(shí)不足，大量病例長(zhǎng)期得不到確診，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球25%的罕見病患者需反復(fù)就醫(yī)5～30年才能被正確診斷，延誤了病情的控制治療，給患者及其家庭造成了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)［1］。人類基因和分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展已經(jīng)證實(shí)，遺傳綜合征大都伴隨顏面部的異常［2］，同一種遺傳綜合征有著相似的面容特征，而且面部特征與種族背景也息息相關(guān)［3］，因此，研究面部特征與遺傳綜合征的關(guān)系為疑難罕見病的診斷開辟了一個(gè)新的方向。

Face2Gene 是一家以色列公司開發(fā)的一款通過臉部照片預(yù)測(cè)遺傳綜合征的應(yīng)用軟件，所采用的面部畸形分析技術(shù)（facial dysmorphology novel analysis，F(xiàn)DNA）將面部識(shí)別軟件與生物知識(shí)相結(jié)合，能夠從二維面部照片中檢測(cè)出畸形特征和可識(shí)別的人類畸形模式［4］，并能夠建立遺傳綜合征的共同特征模式，對(duì)具有相同遺傳綜合征的臉部特征進(jìn)行識(shí)別。因此，本研究運(yùn)用Face2Gene 軟件對(duì)16 例確診為Noonan 綜合征的患者照片進(jìn)行分析，評(píng)估該軟件在臨床中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床早期篩查診斷提供依據(jù)，對(duì)于提高出生人口素質(zhì)、減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇廣東省人民醫(yī)院心兒科2016年11月至2018年10月收治的經(jīng)基因檢測(cè)確診為Noonan 綜合征患兒共16 例（男7 例，性9 例），年齡（3.7 ± 2.5）歲；對(duì)照組非Noonan 綜合征患兒共83 例（男39 例，女44 例），年齡（4.1 ± 3.3）歲，見表1。所有病例取清晰的正面照一張，本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集患兒信息及照片前均由其本人或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

表1 入組病例臨床資料Tab.1 Clinical data of enrolled cases

1.2 遺傳學(xué)檢測(cè)分析

1.2.1 基因組DNA 制備 EDTA 抗凝管采集外周靜脈血2～3 mL，參照《鹽析法血液DNA 提取試劑盒》操作要求制備基因組DNA，用Sim-100 超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的OD值。

1.2.2 二代基因測(cè)序 取1 μg 基因組DNA 用Q800R 超聲破碎儀進(jìn)行打斷，電泳質(zhì)檢峰值在350 bp 左右。然后進(jìn)行末端修復(fù)，3′端加A，兩端加上特定序列的接頭，不同樣本連接不同序列的條形碼，經(jīng)PCR 對(duì)帶有接頭的文庫(kù)放大。Qubit 測(cè)定文庫(kù)的濃度，每例樣本取300 ng 進(jìn)行混合，8 例樣本為一個(gè)混合單位。往混合后樣本中加入人類外顯子文庫(kù)進(jìn)行雜交捕獲，捕獲后產(chǎn)物純化后，經(jīng)過post-PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定文庫(kù)的大小，Qubit 3.0 及熒光定量PCR 測(cè)定文庫(kù)的濃度。質(zhì)檢后文庫(kù)稀釋至上機(jī)測(cè)序濃度，使用Illumina Nextseq 500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序平均覆蓋深度為200X 左右，＞10X 覆蓋區(qū)間占100%，＞20X覆蓋區(qū)間占100%。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，二代測(cè)序原始數(shù)據(jù)的注釋范圍為：每個(gè)外顯子的變異以及外顯子上下游各10 bp內(nèi)含子中的變異，變異類型包括：錯(cuò)義、無義、同義、移碼、整碼、剪切等。對(duì)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，測(cè)序覆蓋深度低于20X 的變異標(biāo)記為低質(zhì)量變異。檢索內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP、ESP6500、ExAC 等人群數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)注單核苷酸多態(tài)性和低頻良性變異。應(yīng)用預(yù)測(cè)軟件對(duì)變異的保守性/致病性/危害性進(jìn)行預(yù)測(cè)。檢索HGMD，Pubmed，Clinvar 等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索變異相關(guān)文獻(xiàn)，分析文獻(xiàn)內(nèi)容，參考ACMG（美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)）變異分類指南，對(duì)變異進(jìn)行分類。根據(jù)基因突變的致病性程度分為5 檔，即“1 類為致病的”、“2 類為可能致病的”、“3 類為意義不明確的”、“4 類為可能良性的”、“5 類為良性的”［5］。

1.3 Noonan 綜合征面部特征分析

1.3.1 Face2Gene 軟件 Face2Gene 軟件結(jié)合了幾種人臉識(shí)別方法，主要是基于局部外觀的識(shí)別和基于格式塔的識(shí)別。在基于局部外觀的識(shí)別中，系統(tǒng)會(huì)根據(jù)視覺線索，直接評(píng)估匹配臉部各個(gè)部位的概率。對(duì)于基于格式塔的識(shí)別，系統(tǒng)會(huì)考慮整個(gè)面部模式，而不會(huì)關(guān)注特定的區(qū)域［6］。具體步驟：首先對(duì)輸入圖像進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)現(xiàn)人臉標(biāo)志點(diǎn)的檢測(cè)和校準(zhǔn)；預(yù)處理后，將輸入圖像裁剪到面部區(qū)域；然后將每個(gè)區(qū)域輸入深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（DCNN）來獲得一個(gè)函數(shù)向量，分析其與模型中的每個(gè)綜合征的對(duì)應(yīng)關(guān)系；最后對(duì)所有區(qū)域DCNNs的輸出向量進(jìn)行聚合和排序，得到最終的遺傳綜合征排序列表。如果臨床醫(yī)生提供添加更多信息，如臨床特征或人體具體量化數(shù)據(jù)，可以提高排名精確度。

1.3.2 研究方法 在Face2Gene 軟件的臨床應(yīng)用中，應(yīng)至少上傳每個(gè)病例的正面照片1 張。由于該軟件只能判定遺傳綜合征型，因此上傳正常人照片后也會(huì)匹配包括30 個(gè)遺傳綜合征的排序列表，按照相似度進(jìn)行排名。此外，對(duì)于上傳的每一個(gè)病例（圖1A），F(xiàn)ace2Gene 軟件會(huì)提供一個(gè)病例庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)化圖片（圖1B），同時(shí)還會(huì)生成一個(gè)熱圖（圖2），熱圖中紅色區(qū)域代表該類綜合征最顯著的標(biāo)記特征，藍(lán)色區(qū)域?yàn)樽畈伙@著特征。根據(jù)既往的研究［7］，規(guī)定Noonan 綜合征出現(xiàn)在所有匹配遺傳綜合征的前10 名時(shí)，將其認(rèn)為陽性結(jié)果，11 名至30 名時(shí)認(rèn)為陰性結(jié)果；若未出現(xiàn)在軟件所匹配的30 個(gè)遺傳綜合征列表中時(shí)，則標(biāo)記為31 名，為陰性結(jié)果。繪制兩組之間每個(gè)等級(jí)的分布直方圖，比較Noonan 綜合征和非Noonan 綜合征識(shí)別匹配的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)結(jié)果 16 例Noonan 綜合征患兒分別檢測(cè)到了BRAF、RAF1、PTPN11、LZTR1、RIT1 五個(gè)致病突變基因，且均為“1 類致病”和“2 類可能致病”，其中PTPN11 數(shù)量是最的，約占44%，見表2。

圖1 Face2Gene 軟件照片分析Fig.1 photo analysis in Face2Gene

圖2 Face2Gene 軟件生成熱圖分析Fig.2 Heat map in Face2Gene

表2 16 例Noonan 綜合征基因檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Genetic results about Noonan syndrome 例

2.2 Face2Gene 分析結(jié)果 在Face2Gene 軟件中共輸入104 例病例照片，其中Noonan 綜合征組16 例，非Noonan 綜合征88 例，其中有5 例照片因面部圖片太小軟件無法識(shí)別而排除。在Noonan綜合征組中，16 例患兒匹配項(xiàng)中Noonan 綜合征全部排名在前10，即16 例全部為陽性，其中有12 例排名為第1 位；非Noonan 綜合征組，有15 例排名在前10，即陽性率為18%。兩組之間各個(gè)排名數(shù)量見圖3，經(jīng)計(jì)算，F(xiàn)ace2Gene 軟件對(duì)Noonan 綜合征的分析檢測(cè)靈敏度為100%，特異度為82%，準(zhǔn)確度為85%。

圖3 兩組各個(gè)排名數(shù)量分布情況Fig.3 Ranking distribution of the two groups

3 討論

Noonan 綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，活產(chǎn)新生兒中發(fā)病率為1/2 500～1/1 000［8］，1968年NOONAN［9］首次報(bào)道了19 例該類患者，并以此命名為Noonan 綜合征。2001年，TARTAGLIA 等［10］首次確定Noonan 綜合征2 型患者的非受體蛋白酪氨酸磷酸化酶基因（PTPN11）錯(cuò)義突變，并在該基因缺陷的小鼠模型上證實(shí)，其編碼蛋白產(chǎn)物SHP-2在心臟瓣膜的胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用［11］，其參與調(diào)控一系列生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致患兒生長(zhǎng)遲緩和骨骼異常等多種臨床表現(xiàn)。通過查詢OMIM，即在線《人類孟德爾遺傳》（https：//www.omim.org/）發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同的基因突變位點(diǎn)，可將Noonan 綜合征分為10 個(gè)亞型。在本研究中發(fā)現(xiàn)了其中5 個(gè)致病基因，分別為BRAF、RAF1、PTPN11、LZTR1、RIT1，以PTPN11 數(shù)量最多，這與此前的報(bào)道是一致的［12］。

遺傳綜合征患兒普遍存在面容的異常，而且同一種綜合征面容極為相似，例如21-三體綜合征、williams 綜合征等，Noonan 綜合征是臨床上一種罕見的遺傳綜合征，該類患兒也具有獨(dú)特且相似的面部特征：上瞼下垂、內(nèi)眥贅皮、眼距增寬、鼻梁高、鼻孔大而上翻、嘴大且嘴角下斜、蹼頸，還常常伴有身材矮小，雞胸或漏斗胸，凝血異常和肥厚性心肌病、肺動(dòng)脈狹窄等。2017年，KRUSZKA 等［13］對(duì)來自20 多個(gè)國(guó)家不同種族的161 例Noonan 綜合征患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，除了上瞼下垂和蹼頸有差異外，Noonan 綜合征在不同人群中的臨床表現(xiàn)是相似的，其中超過70%的患者都有3 個(gè)共同的臨床特征：眼距增寬、耳位低和身材矮小。

Face2Gene 軟件是一款基于深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（DCNN）［14-15］、通過臉部照片預(yù)測(cè)遺傳綜合征的應(yīng)用軟件［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ace2Gene 軟件對(duì)16 例Noonan 綜合征患兒面部圖片進(jìn)行分析匹配，其陽性率高達(dá)100%，即靈敏度100%，這可能與人們不斷上傳來自世界各地不同種族的同一類疾病的照片有關(guān)，使得Face2Gene 軟件的靈敏度不斷提高［17-18］；而在非Noonan 綜合征組中，F(xiàn)ace2Gene 軟件分析匹配結(jié)果認(rèn)為約82%（68/83）為陰性，即特異度為82%，但是仍有18%（15/83）的非Noonan綜合征患者被誤認(rèn)為Noonan綜合征，這可能與軟件本身的局限性有關(guān)，F(xiàn)ace2Gene 軟件默認(rèn)所有上傳的照片中的人均為綜合征患者，即正常人也會(huì)匹配30個(gè)遺傳綜合征，因此在非Noonan 綜合征組中會(huì)出現(xiàn)假陽性。在本研究中，F(xiàn)ace2Gene 軟件對(duì)Noonan 綜合征的檢測(cè)靈敏度為100%，特異度為82%，準(zhǔn)確度為85%，由此筆者認(rèn)為運(yùn)用Face2Gene 軟件對(duì)Noonan綜合征進(jìn)行分析是有效可行的，截止2018年11月14日，F(xiàn)ace2Gene 軟件上傳照片數(shù)已達(dá)314 270 張（https：//www.face2gene.com/），筆者相信隨著上傳病例數(shù)的不斷增多，該軟件對(duì)Noonan綜合征檢測(cè)的靈敏度、特異度會(huì)更高。查閱資料發(fā)現(xiàn)（https：//www.omim.org/），根據(jù)不同的基因突變位點(diǎn)，Noonan 綜合征有不同的10 個(gè)亞型，但是對(duì)于本研究中的16 例Noonan綜合征患兒，該軟件分析結(jié)果中沒有對(duì)其進(jìn)行分型，分析是由于該軟件目前尚處于病例庫(kù)建立初步階段，同一類疾病數(shù)量有限，但是隨著病例數(shù)逐漸增多以及數(shù)據(jù)的進(jìn)一步完善，該軟件會(huì)對(duì)每一類疾病的分析及分型做到更加精細(xì)。

綜上所述，F(xiàn)ace2Gene 軟件對(duì)于Noonan 綜合征的分析識(shí)別靈敏度較高，可以幫助臨床醫(yī)生特別是基層醫(yī)生快速篩查、識(shí)別Noonan 綜合征，可提高臨床醫(yī)生對(duì)該類疾病的認(rèn)識(shí)，減少誤診漏診率，優(yōu)化治療策略，有效開展遺傳咨詢工作，對(duì)于提高出生人口素質(zhì)、減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。但是在本研究中，由于病例樣本量不足，對(duì)于Noonan 綜合征面部特征分析不夠全面，需更大樣本的研究進(jìn)行驗(yàn)證，下一步將推廣至大范圍地區(qū)；其次，F(xiàn)ace2Gene 是國(guó)外FDNA 公司開發(fā)的一款軟件，目前為免費(fèi)檢測(cè)收集數(shù)據(jù)階段，而且由于人類種族的差異性，自主研發(fā)一款適合亞洲人的人臉識(shí)別軟件是十分有意義的，今后本團(tuán)隊(duì)將致力于研發(fā)適合亞洲人基于特殊面容特征的人工智能輔助診斷軟件，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育及減少出生缺陷具有重大意義。