劉元 周俊 崔曉利 雷佳媛 黨麗云

耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)，在許多國家已經(jīng)成為重大的公共衛(wèi)生問題和全球結(jié)核病有效控制的障礙。據(jù)WHO估計(jì)，2017年全球新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病(RR-TB)患者55.8萬例，其中82%為MDR-TB，我國結(jié)核病患者對(duì)利福平的耐藥率依然高居全球第二[1]。目前，MTB的表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)由于耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，已難以滿足耐藥結(jié)核病的診療需要，而分子生物學(xué)藥敏試驗(yàn)方法以其簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)已成為結(jié)核病快速診斷的重要手段[2]?；蛐酒夹g(shù)和線性探針技術(shù)(GenoType MTBDRplus)是兩種比較常用的分子生物學(xué)藥敏試驗(yàn)方法[3-4]?；蛐酒夹g(shù)可以檢測(cè)耐藥基因突變位點(diǎn)，避免檢出與耐藥無關(guān)位點(diǎn)突變而導(dǎo)致的假陰性[2]；線性探針技術(shù)是WTO推薦的涂陽肺結(jié)核患者的耐藥檢測(cè)技術(shù)。兩種方法檢測(cè)耐藥基因的覆蓋位點(diǎn)各有不同。目前，雖然有文獻(xiàn)分別就兩種方法的檢測(cè)效能進(jìn)行了評(píng)價(jià)[3-4]，但對(duì)兩種方法的對(duì)比研究較少。筆者通過對(duì)454例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測(cè)，分析兩種方法的異同。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選取西安市胸科醫(yī)院2017年4月至2018年8月確診并住院治療的493例涂陽肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，其中，初治患者386例，復(fù)治患者107例。收集研究對(duì)象痰標(biāo)本，痰標(biāo)本量均不少于2 ml。每例患者用同一份痰標(biāo)本分別進(jìn)行基因芯片檢測(cè)、線性探針檢測(cè)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)陽性且鑒定為MTB的臨床分離株進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)。

二、試驗(yàn)方法

1.儀器與試劑：(1)儀器：PCR擴(kuò)增儀、芯片雜交儀和微陣芯片掃描讀片儀(北京博奧生物有限公司)；GT-Blot 48雜交儀(法國生物梅里埃公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)。(2)試劑：晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(北京博奧生物有限公司)；GenoType MTBDRplus ver 1.0試劑盒(法國生物梅里埃公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥敏試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(美國BD公司)；MPT64快速抗原檢測(cè)試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)。

2.標(biāo)本前處理：采用中和離心法去污染處理，涂陽痰標(biāo)本采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液處理15 min，加磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 ml，在4 ℃下3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入1.5 ml PBS振蕩重懸。重懸后的痰標(biāo)本各取0.5 ml分別進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)、基因芯片檢測(cè)和線性探針檢測(cè)。

3.MGIT 960液體培養(yǎng)：參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》及MGIT 960液體培養(yǎng)操作手冊(cè)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。取0.5 ml前處理后的痰標(biāo)本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，放入MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。一旦MGIT 960培養(yǎng)管通過儀器報(bào)告呈陽性，使用痰涂片鏡檢確認(rèn)陽性產(chǎn)物，并用MPT64快速抗原檢測(cè)試劑確認(rèn)陽性產(chǎn)物為MTB。

4. MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)：取MTB陽性產(chǎn)物0.5 ml接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度1 μg/ml，異煙肼藥物濃度0.1 μg/ml)。另取0.2 ml陽性產(chǎn)物用PBS稀釋100倍后，取0.5 ml接種到生長(zhǎng)對(duì)照管中，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照管中生長(zhǎng)單位(growth unit，GU)指數(shù)達(dá)到400時(shí)(4～13 d內(nèi))，評(píng)估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感，含藥培養(yǎng)管的GU值≥100為耐藥。

5.基因芯片法耐藥基因檢測(cè)：應(yīng)用核酸提取試劑盒提取研究對(duì)象痰標(biāo)本中的MTB-DNA，進(jìn)一步按照晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌、甩干及結(jié)果掃描。

6.線性探針法耐藥基因檢測(cè)：采用超聲裂解法提取研究對(duì)象痰標(biāo)本中的MTB-DNA。取5 μl提取后的DNA加入已準(zhǔn)備好的45 μl擴(kuò)增混合物，按照說明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取20 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時(shí)為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，分析基因芯片技術(shù)及線性探針技術(shù)檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的效能，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75時(shí)認(rèn)為兩者一致性較好。

結(jié) 果

一、基本情況

493例研究對(duì)象痰標(biāo)本經(jīng)MGIT 960液體培養(yǎng)，陰性18例(3.7%)、污染6例(1.2%)、陽性469例(95.1%)；培養(yǎng)陽性的469例研究對(duì)象，經(jīng)鑒定5例(1.1%)為非結(jié)核分枝桿菌感染，464例研究對(duì)象完成了表型藥敏試驗(yàn)。493例研究對(duì)象痰標(biāo)本經(jīng)基因芯片檢測(cè)，469例具有藥敏試驗(yàn)結(jié)果；經(jīng)線性探針檢測(cè)，472例具有藥敏試驗(yàn)結(jié)果。共有454例研究對(duì)象同時(shí)具有表型藥敏試驗(yàn)、基因芯片檢測(cè)及線性探針檢測(cè)結(jié)果。

二、MTB利福平耐藥性檢測(cè)結(jié)果分析

454例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，經(jīng)MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥73例，耐藥率為16.1%。以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法和線性探針法檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值見表1。Kappa檢驗(yàn)顯示，基因芯片法和線性探針法藥敏檢測(cè)與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)均具有較好的一致性。

三、MTB異煙肼耐藥性檢測(cè)的結(jié)果分析

454例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，經(jīng)MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥116例，耐藥率為25.6%。以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法和線性探針法檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值見表2。Kappa檢驗(yàn)顯示，基因芯片法和線性探針法藥敏檢測(cè)與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)均具有較好的一致性。

表1 兩種分子生物學(xué)檢測(cè)方法以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者 痰標(biāo)本MTB利福平耐藥性效能

表2 兩種分子生物學(xué)檢測(cè)方法以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者 痰標(biāo)本MTB異煙肼耐藥性效能

四、兩種分子生物學(xué)檢測(cè)方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

454例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，453例應(yīng)用2種分子生物學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)MTB利福平耐藥性結(jié)果相同,符合率為99.8%。1例線性探針檢測(cè)為rpoB基因S531L突變，基因芯片檢測(cè)為敏感。445例應(yīng)用2種方法檢測(cè)MTB異煙肼耐藥性結(jié)果相同，符合率為98.0%。9例不一致結(jié)果中，5例線性探針檢測(cè)為異煙肼耐藥，分別是2例katG基因S315T2突變即315(AGC→ACA)突變，3例inhA基因-8(T→C)突變，而基因芯片檢測(cè)結(jié)果均為敏感。4例基因芯片檢測(cè)為異煙肼耐藥，均為katG基因315(AGC→AAC)突變，線性探針檢測(cè)結(jié)果均為敏感(如圖1中所示的4、13、32、93號(hào)標(biāo)本條帶)。

圖中右側(cè)箭頭從上至下所示分別為93、32、13、4號(hào)標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的線性探針顯色條帶(此4份標(biāo)本katG WT條帶顯色強(qiáng)度均弱于katG 條帶)。圖中上側(cè)箭頭及下側(cè)箭頭所示為本研究所關(guān)注的katG和katG WT基因顯色條帶。93、32、13、4號(hào)標(biāo)本經(jīng)基因芯片檢測(cè)均為katG 315 (AGC→AAC)突變，而線性探針檢測(cè)條帶顯示其katG WT 條帶并未缺失(突變條帶也未出現(xiàn))，卻有不同程度的減弱，且katG WT條帶顯色強(qiáng)度均弱于katG 條帶。這與katG基因真正的野生型條帶明顯不同，真正野生型katG WT條帶顯色強(qiáng)度均強(qiáng)于katG 條帶圖1 線性探針法檢測(cè)MTB異煙肼耐藥基因katG 315 (AGC→AAC)突變時(shí)的顯色條帶

討 論

基因芯片和線性探針技術(shù)是兩種能夠快速檢測(cè)MTB利福平和異煙肼耐藥性的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，其最大優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)快速，均能在6 h內(nèi)獲得藥敏結(jié)果。兩種方法雖然都是通過檢測(cè)rpoB基因、katG基因和inhA基因的突變來檢測(cè)MTB利福平和異煙肼的耐藥性，但其檢測(cè)耐藥基因的覆蓋位點(diǎn)各有不同。例如：對(duì)于MTB利福平耐藥性的檢測(cè)，基因芯片技術(shù)僅檢測(cè)了rpoB基因核心突變區(qū)的6個(gè)位點(diǎn)(531、526、516、511、533、513)的13種突變類型，而線性探針技術(shù)則通過8條分子探針覆蓋了rpoB基因核心突變區(qū)的全部27個(gè)氨基酸的81個(gè)堿基。本次研究，筆者就兩種方法檢測(cè)結(jié)果的異同進(jìn)行了對(duì)比分析。

本研究中，以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89.0%和96.1%；線性探針檢測(cè)的敏感度和特異度分別為90.4%和96.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致[5-7]。兩種方法檢測(cè)結(jié)果有1例不同，線性探針法檢測(cè)為rpoB基因S531L突變，基因芯片法檢測(cè)為敏感，可能由操作誤差所致。本次研究未發(fā)現(xiàn)rpoB基因6個(gè)常見突變位點(diǎn)以外的突變，表明基因芯片檢測(cè)位點(diǎn)以外的突變相當(dāng)稀少，與歐維正等[8]報(bào)道的基因芯片檢測(cè)位點(diǎn)之外的位點(diǎn)突變僅為0.33%(9/2738)一致。與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，兩種方法對(duì)MTB利福平耐藥性的檢測(cè)均具有較高的一致性(Kappa值>0.75)，表明基因芯片和線性探針兩種技術(shù)都能夠勝任本地區(qū)MTB利福平耐藥性的快速檢測(cè)。

MTB對(duì)異煙肼的耐藥機(jī)制較復(fù)雜。目前研究發(fā)現(xiàn)，至少有katG、inhA、ahpC、kasA、ndh等5種不同的基因突變與異煙肼的抗藥性有關(guān)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，katG315位點(diǎn)和inhA-15位點(diǎn)突變占異煙肼耐藥突變的80%以上[9-10]。由于基因芯片和線性探針檢測(cè)的分子載量有限，故兩種方法都是通過檢測(cè)katG基因和inhA基因突變實(shí)現(xiàn)對(duì)MTB異煙肼耐藥性的預(yù)測(cè)。

本研究中，以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB異煙肼耐藥性的敏感度和特異度分別為80.2%和96.7%；線性探針檢測(cè)的敏感度和特異度分別為81.9%和97.0%。兩種方法的檢測(cè)效能相差不大，但兩種方法檢測(cè)結(jié)果仍有9例不同，這是由于兩種檢測(cè)方法覆蓋的突變位點(diǎn)不同所致，如線性探針含有katG315(AGC→ACA)、inhA-16(T→G)、inhA-8(T→C)和inhA-8(T→A)突變類型，而基因芯片有katG315(AGC→AAC)突變類型，這些突變類型在文獻(xiàn)[4]和[11]中均能看到，但突變頻率均不高。

在本研究中，通過對(duì)基因芯片和線性探針檢測(cè)結(jié)果的逐一對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)MTB在發(fā)生katG315(AGC→AAC)突變時(shí)，由于線性探針未涵蓋該突變，其檢測(cè)結(jié)果如圖1中4、13、32、93號(hào)標(biāo)本條帶：野生型條帶既未缺失，突變型條帶也未出現(xiàn)，根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)判為敏感。但筆者發(fā)現(xiàn)在這種情況下，4例標(biāo)本的顯示條帶都具有共同特征：“katGWT”條帶會(huì)有不同程度的減弱，且“katGWT”條帶的顯色均弱于“katG”條帶，這與真正野生型的條帶是不同的。對(duì)比其他349條katG基因野生型的條帶，發(fā)現(xiàn) “katGWT”條帶的顯色均強(qiáng)于“katG”條帶(圖1中4、13、32、93號(hào)標(biāo)本條帶以外的條帶)，這與許多文獻(xiàn)上展示的條帶帶型也是一致的[12-13]。分析發(fā)生katG315(AGC→AAC)突變時(shí)“katGWT”條帶減弱的原因，可能是與異質(zhì)性耐藥有關(guān)。異質(zhì)性耐藥是一種客觀存在的現(xiàn)象，即結(jié)核病患者體內(nèi)通常敏感菌和耐藥菌并存[2]，在這種情況下，野生型細(xì)菌可以顯色，而突變型細(xì)菌則不能顯色，且由于不同患者突變菌所占的比例不同，所以 “katGWT”條帶的顯色強(qiáng)弱也不同，突變菌所占比例越高則“katGWT”條帶顯色越弱直至缺失。根據(jù)本研究的對(duì)比結(jié)果，在應(yīng)用線性探針進(jìn)行MTB異煙肼耐藥基因檢測(cè)時(shí)，如果出現(xiàn)“katGWT”條帶顯色弱于“katG”條帶的情況，則該患者極有可能發(fā)生katG基因的突變，建議通過測(cè)序或其他方法確認(rèn)。目前，二代線性探針在臨床上已經(jīng)有所應(yīng)用，其和一代產(chǎn)品的最大差異是提高了檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB的敏感度，可直接檢測(cè)涂陰肺結(jié)核患者的耐藥性。筆者提出的“如果出現(xiàn)‘katGWT’條帶顯色弱于‘katG’條帶則極有可能具有katG突變”是否也適用于二代產(chǎn)品則還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，基因芯片技術(shù)與線性探針技術(shù)檢測(cè)涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中MTB利福平和異煙肼耐藥性與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果具有較高的一致性，由于兩類檢測(cè)方法各自有其優(yōu)缺點(diǎn)，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以選擇進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)?；蛐酒夹g(shù)和線性探針技術(shù)具有同等的檢測(cè)效能，都可應(yīng)用于本地區(qū)的結(jié)核耐藥檢測(cè)。由于兩種分子生物學(xué)方法覆蓋耐藥基因的位點(diǎn)不同，故檢測(cè)結(jié)果會(huì)有所差異。當(dāng)線性探針的顯色結(jié)果中“katGWT”條帶的顯色弱于“katG”條帶時(shí)，該患者極有可能已經(jīng)發(fā)生katG基因突變，建議再通過測(cè)序或其他方法確認(rèn)。