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      超聲分散比濁法處理BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性的菌液標(biāo)本用于藥物敏感性試驗(yàn)的價(jià)值

      2019-07-11 06:45:28楊翰楊靜芬談小文李愛芳崔曉利康磊黨麗云
      中國防癆雜志 2019年7期
      關(guān)鍵詞:麥?zhǔn)?/a>濁法菌液

      楊翰 楊靜芬 談小文 李愛芳 崔曉利 康磊 黨麗云

      近年來,雖然分子生物學(xué)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)方法發(fā)展迅速[1-2],但其檢測范圍并不能包含所有抗結(jié)核藥物,并且實(shí)驗(yàn)儀器費(fèi)用昂貴,所以表型藥敏試驗(yàn)仍然為大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,以為結(jié)核病的臨床治療提供全面的藥敏信息。但在日常操作中,BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體藥敏試驗(yàn)因標(biāo)本菌量的問題,會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果有一定的報(bào)錯(cuò)率;固體藥敏試驗(yàn)時(shí),人工磨菌比濁又受人為因素影響較大,這些都對藥敏試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。筆者使用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀對MGIT 960培養(yǎng)物進(jìn)行超聲分散比濁,分析其在不同藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

      資料和方法

      一、研究資料

      1.資料收集:搜集2018年1—12月西安市胸科醫(yī)院經(jīng)MGIT 960液體分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌液標(biāo)本,共計(jì)1086份(培養(yǎng)陽性的菌液標(biāo)本來自于臨床各類型標(biāo)本,包含痰液、支氣管沖洗液及各類型體液標(biāo)本等)。其中,818份菌液標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960 液體藥敏試驗(yàn),包括MGIT 960推薦方法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“MGIT 960 法標(biāo)本”)100份、超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“超聲比濁法標(biāo)本”)718份;268份菌液標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn),包括傳統(tǒng)磨菌法處理的菌液標(biāo)本(簡稱“磨菌法標(biāo)本”)30份、超聲比濁法標(biāo)本238份。

      2.儀器與試劑:MGIT 960 液體藥敏試驗(yàn)應(yīng)用MGIT 960試劑盒(批號:804944;BACTECTMMGIT 960操作系統(tǒng),購自美國BD公司);比例法藥敏試驗(yàn)應(yīng)用分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)法;批號:1806181;購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司);細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀(型號:BACspreaderTM1100)、比濁管(批號:20180119)、細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)液(批號:20180111),均購自廣東體必康生物科技有限公司。

      二、MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)(MGIT 960法)

      1.MGIT 960法菌液準(zhǔn)備[3]:取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽且菌種鑒定為MTB的菌液,以報(bào)陽當(dāng)天算作第0天,如果在第1、2天進(jìn)行操作,則直接為工作菌液進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種;如果在第3~5天進(jìn)行操作,則用滅菌生理鹽水按照1∶5稀釋為工作菌液(1 ml 菌懸液,4 ml生理鹽水),然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種。

      2.超聲分散比濁法菌液準(zhǔn)備[4]:取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽且菌種鑒定為MTB的菌液,加入2 ml至磨菌管中。工作參數(shù)為超聲5 s、間隔5 s;持續(xù)1 min。超聲后記錄濁度。本次研究濁度范圍為0.4~1.0麥?zhǔn)蠁挝弧⑾鄳?yīng)的濁度稀釋至0.1麥?zhǔn)蠁挝坏墓ぷ饕篬3],然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種。

      3.含藥培養(yǎng)基準(zhǔn)備[3]:于MGIT 960試劑盒取5只培養(yǎng)管。第一管標(biāo)記GC(空白對照),其余4只管分別標(biāo)記Sm(鏈霉素)、INH(異煙肼)、RFP(利福平)、EMB(乙胺丁醇)。無菌操作下每管加入0.8 ml增菌劑;4 ml滅菌蒸餾水溶解藥物干粉,在相應(yīng)含藥標(biāo)記管加入100 μl相應(yīng)藥物;對照管內(nèi)加入0.5 ml 的1∶100倍稀釋的工作菌液(0.1 ml菌液,10 ml滅菌生理鹽水),其余4管含藥培養(yǎng)基加入工作菌液0.5 ml,蓋緊螺旋蓋并混勻。

      4.結(jié)果報(bào)告:將上述培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng),等待報(bào)告結(jié)果。若報(bào)告X200則為活菌含量較少;報(bào)告X400則為活菌含量較高,雜菌生長,即污染;以上兩種結(jié)果表示試驗(yàn)失敗。儀器正常報(bào)告藥敏結(jié)果則為試驗(yàn)成功。該指標(biāo)為效果指標(biāo),用于判斷試驗(yàn)成功與否,而非評價(jià)指標(biāo)的依據(jù)。

      三、比例法藥敏試驗(yàn)

      1. 超聲分散比濁法菌液準(zhǔn)備:取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽且菌種鑒定為MTB的菌液,加入2 ml至磨菌管中,工作參數(shù)為超聲5 s、間隔5 s;持續(xù)1 min。超聲后記錄濁度。本次研究濁度范圍為0.4~1.0麥?zhǔn)蠁挝?。將相?yīng)的濁度稀釋至0.1麥?zhǔn)蠁挝坏墓ぷ饕?,將工作液?.1 ml進(jìn)行1∶10稀釋(0.5 ml菌液,4.5 ml滅菌生理鹽水)得到10-2菌懸液。將10-2菌懸液按1∶100稀釋(0.1 ml菌液,10 ml滅菌生理鹽水)得到10-4菌懸液。

      2.傳統(tǒng)比濁法菌液準(zhǔn)備:取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽且菌種鑒定為MTB的菌液,按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行磨菌操作,與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁,得到1麥?zhǔn)蠁挝还ぷ饕?,將工作液菌懸液?∶100稀釋(0.1 ml菌液,10 ml滅菌生理鹽水)得到10-2菌懸液,將10-2菌懸液按1∶100稀釋(0.1 ml菌液,10 ml 滅菌生理鹽水)得到10-4菌懸液。

      3.藥敏試驗(yàn)接種:將10-2、10-4菌懸液,分別接種到2支對照培養(yǎng)基及2支相應(yīng)含藥培養(yǎng)基上。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35~37 ℃,培養(yǎng)4周后進(jìn)行結(jié)果判讀[3]。若高稀釋度的對照培養(yǎng)基菌落數(shù)<20個(gè),則判斷為試驗(yàn)失??;對照培養(yǎng)基菌落數(shù)≥20個(gè)則為試驗(yàn)成功。該指標(biāo)為效果指標(biāo),非評價(jià)指標(biāo)的依據(jù)。

      四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)菌液標(biāo)本制備方法比較,分析超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本用于MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)和比例法藥敏試驗(yàn)的效果。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      一、超聲比濁法標(biāo)本用于液體藥敏試驗(yàn)的價(jià)值

      濁度為0.6~1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果的時(shí)間主要集中在8~10 d,而MGIT 960 法標(biāo)本報(bào)告結(jié)果時(shí)間則較均勻分布在5~14 d。應(yīng)用MGIT 960 法標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)時(shí),系統(tǒng)報(bào)告X200的報(bào)告率為11.00%(11/100),X400報(bào)告率為4.00%(4/100)。應(yīng)用超聲比濁法標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)時(shí),不同濁度標(biāo)本系統(tǒng)X200報(bào)告率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=227.78,P<0.01);濁度為0.4和0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)本系統(tǒng)X200報(bào)告率均高于MGIT 960菌液制備法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為27.75和9.12,P值均<0.01);濁度為0.6~1.0麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)本系統(tǒng)X200報(bào)告率均低于MGIT 960菌液制備法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為11.41、9.94、12.43、12.79、11.28,P值均<0.01)。兩種方法制備菌液標(biāo)本系統(tǒng)X400報(bào)告率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.85,P=0.257)。具體見表1。

      二、超聲比濁法標(biāo)本用于比例法藥敏試驗(yàn)的價(jià)值

      進(jìn)行二線抗結(jié)核藥物比例法藥敏試驗(yàn)時(shí),隨著繼續(xù)增菌天數(shù)的增加,應(yīng)用超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本達(dá)到1麥?zhǔn)蠁挝粷岫裙ぷ饕旱谋嚷矢哂趥鹘y(tǒng)磨菌法處理的菌液標(biāo)本;增菌6~7 d后,應(yīng)用超聲分散比濁法處理的菌液標(biāo)本基本可以達(dá)到目標(biāo)濁度,而傳統(tǒng)磨菌法處理的標(biāo)本在增菌第7天時(shí)僅有80%達(dá)到目標(biāo)濁度(圖1)。應(yīng)用超聲分散比濁法處理的0.4~0.6麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)的成功率分別為4.00%(1/25)、12.50%(3/24)、42.86%(6/14),均明顯低于磨菌法標(biāo)本[83.33%(25/30)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為34.43、26.80、7.51,P值均<0.05);0.7~1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶?biāo)本試驗(yàn)成功率分別為82.61%(19/23)、82.69%(43/52)、94.00%(47/50)、96.00%(48/50),與磨菌法標(biāo)本試驗(yàn)成功率相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為0.01、0.01、2.37、3.77,P值均>0.05),見圖2。

      表1 應(yīng)用超聲比濁法制備的不同濁度菌液標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)時(shí)系統(tǒng)報(bào)錯(cuò)情況

      注X200表示檢測標(biāo)本活菌含量較少;X400表示檢測標(biāo)本污染

      圖1 超聲分散比濁法和傳統(tǒng)磨菌法制備菌液標(biāo)本達(dá)到比例法藥敏試驗(yàn)標(biāo)本目標(biāo)濁度效果分析圖

      圖2 采用超聲比濁法標(biāo)本和磨菌法標(biāo)本進(jìn)行二線抗結(jié)核藥物比例法藥敏試驗(yàn)的效果比較

      討 論

      目前,MGIT 960液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)系統(tǒng)已經(jīng)常規(guī)使用[5]。但在實(shí)際應(yīng)用過程中,MGIT 960藥敏試驗(yàn)有一定的報(bào)錯(cuò)率,且該方法目前僅針對一線抗結(jié)核藥物,而針對二線抗結(jié)核藥物的藥敏檢測還需應(yīng)用比例法藥敏試驗(yàn)。MGIT 960液體培養(yǎng)物報(bào)陽后使用傳統(tǒng)磨菌法制備的菌液往往濁度不能達(dá)標(biāo),需要進(jìn)一步增菌,從而延長了藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告時(shí)間。本次研究顯示,應(yīng)用超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本可以有效解決菌液標(biāo)本濁度達(dá)標(biāo)的問題。

      MGIT 960液體培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)管報(bào)陽時(shí)管內(nèi)的菌量是存在差異的,這種差異與每份標(biāo)本中含菌量有關(guān)。菌量較少的標(biāo)本,培養(yǎng)管內(nèi)會(huì)出現(xiàn)由單個(gè)細(xì)菌繁殖成的大塊索狀細(xì)菌團(tuán),雖然其達(dá)到了報(bào)陽所需的耗氧量,但實(shí)際菌量往往較少,也不容易通過高速旋渦振蕩來分散。這部分培養(yǎng)物在進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)時(shí),系統(tǒng)報(bào)告X200(對照無生長)的概率很大。本研究結(jié)果顯示,超聲分散比濁法可將索狀生長的分枝桿菌有效分散,濁度為0.6~1.0麥?zhǔn)蠁挝痪簶悠废到y(tǒng)X200報(bào)告率明顯低于MGIT 960法制備的菌液樣品。雖然報(bào)告結(jié)果時(shí)間固定在8~10 d,但減少了重復(fù)試驗(yàn)的幾率,對患者治療及試驗(yàn)成本的節(jié)約都具有一定的優(yōu)勢。此外,超聲分散比濁法雖然增加了比濁的試驗(yàn)步驟,但只要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,系統(tǒng)報(bào)告X400(污染)的概率與MGIT 960法沒有太大差異。

      在比例法藥敏試驗(yàn)中,如果使用傳統(tǒng)的磨菌瓶磨菌,因技術(shù)限制,需要的菌量大,MGIT 960液體培養(yǎng)報(bào)陽后,往往達(dá)不到1麥?zhǔn)蠁挝?,需要將培養(yǎng)物繼續(xù)放在孵育箱內(nèi)進(jìn)行增菌。如此,則藥敏試驗(yàn)時(shí)間就會(huì)增加,甚至延長到1周以上,延誤了結(jié)果的報(bào)告時(shí)間。MGIT 960液體培養(yǎng)報(bào)陽后樣品利用超聲分散比濁法磨菌,不存在菌液浪費(fèi),菌量基本能滿足0.7麥?zhǔn)蠁挝唬?.7~1.0麥?zhǔn)蠁挝环秶鷥?nèi)菌液標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)的成功率與傳統(tǒng)磨菌法制備標(biāo)本相近。因此,應(yīng)用超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)品在保證了藥敏試驗(yàn)成功率的前提下,可以縮短試驗(yàn)時(shí)間。

      綜上,本次研究結(jié)果顯示,使用超聲分散比濁法制備菌液標(biāo)本用于MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)可以減少出錯(cuò)率;用于固體比例法藥敏試驗(yàn)可以縮短試驗(yàn)時(shí)間。并且,已有研究顯示,超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)本并不影響MTB菌株活性,對藥敏試驗(yàn)的結(jié)果無影響[4, 6]。特別強(qiáng)調(diào),本次研究主要探討效果性指標(biāo),并未關(guān)注應(yīng)用超聲分散比濁法處理菌液標(biāo)本對藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性和重復(fù)性的影響。

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