唐桃霞，王致和，張秀華，周彥芳，謝忠清

（甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威733006）

0 引言

甜葉菊（Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl.）是菊科甜葉菊屬多年生草本植物，又名甜草、甜菊，原產(chǎn)于巴拉圭、巴西等國(guó)家[1]。甜葉菊含有14種微量元素，32種營(yíng)養(yǎng)成分，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其最為重要的次生代謝產(chǎn)物——甜菊糖苷（Steviol glycosides），是作為甜葉菊主要提取物的新型天然甜味劑[2-3]，其中蛇菊苷（Stevioside，STV）和萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）為含量最高的兩個(gè)組分，RA的含量?jī)H次于STV，甜度極高，約為蔗糖的300倍，其甜味最接近蔗糖，比STV的甜味更為甘醇，澀味少[4]，市場(chǎng)前景廣闊[5]。有效評(píng)價(jià)甜葉菊種質(zhì)是選育高產(chǎn)、高RA含量甜葉菊品種的前提條件。影響甜葉菊品種優(yōu)劣的因素眾多，如果僅憑單個(gè)性狀來(lái)評(píng)價(jià)而忽略其它因素，在一定程度上割裂了各性狀對(duì)品質(zhì)的綜合影響，則有失全面性[6]，而灰色關(guān)聯(lián)度評(píng)價(jià)能夠綜合考慮諸多因素，對(duì)品種的評(píng)價(jià)更加客觀、合理[7]，在其他作物上已有應(yīng)用[8-10]，而在甜葉菊種質(zhì)資源綜合評(píng)價(jià)方面目前還存在空白。因此，本文以7份甜葉菊材料為研究對(duì)象，利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在客觀、全面地評(píng)價(jià)甜葉菊種質(zhì)，為甜葉菊新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試7份甜葉菊種質(zhì)材料是從國(guó)內(nèi)各地引進(jìn)的甜葉菊優(yōu)良品種的母根扦插苗，分別為GT-1、GY-23、GY-24、GY-25、GY-26、GY-27、GY-28，將以上7份材料用代號(hào) X1、X2、…、X7表示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于甘肅省武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院試驗(yàn)基地（103°05′E，37°30′N），海拔1 740 m，屬大陸性干旱氣候，年平均氣溫7.7℃，年平均降雨量194.75 mm，年均日照時(shí)數(shù)2 724.8 h，無(wú)霜期150 d左右。供試土壤為砂壤土，肥力均勻。將從各地引入的不同品種的母根移栽至溫室，于2018年3月30日剪取插穗扦插，扦插苗長(zhǎng)至2018年5月16日，移栽至鋪有黑色地膜的試驗(yàn)小區(qū)，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積60 m2，每膜4行，重復(fù)3次，株距約0.2 m，行距約0.4 m，保苗約12 000株/hm2。于9月6日取樣測(cè)產(chǎn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

采收期對(duì)小區(qū)中間行植株進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定及農(nóng)藝性狀考察，考察的農(nóng)藝性狀包括株高（K1）、主莖粗（K2）、一級(jí)分枝數(shù)（K3）、葉長(zhǎng)（K4）、葉寬（K5）、葉厚（K6）、單株鮮葉重（K7）、單株干葉重（K8）、葉莖比（K9）；考察干葉公頃產(chǎn)量（K10）；考察的品質(zhì)性狀包括RA含量（K11）、RA/總苷（%）（K12），RA公頃產(chǎn)量（K13），共13個(gè)指標(biāo)，具體方法如下：

株高：測(cè)定時(shí)取中間行20株，每株用卷尺自地面量至生長(zhǎng)點(diǎn)；主莖粗：用游標(biāo)卡尺測(cè)定莖基部1 cm處的粗度；葉長(zhǎng)：從生長(zhǎng)點(diǎn)向下數(shù)第5對(duì)葉子，從葉尖量至葉基處；葉寬：量取葉子中間最寬處；葉厚采用游標(biāo)卡尺測(cè)量，測(cè)定葉子中間厚度（不包括主葉脈）；將莖葉分離后，測(cè)定單株鮮葉重；自然陰干后，65℃烘箱烘至恒重，稱量各材料的單株干葉重，單株干莖重，計(jì)算葉莖比，然后將干葉粉細(xì)后，裝入樣品袋待測(cè)糖苷。

采用Waters 2695高效液相色譜儀測(cè)定糖苷含量，優(yōu)GB 8270-2014標(biāo)準(zhǔn)，流動(dòng)相為乙腈和磷酸緩沖液，體積比為32∶68，色譜柱為蘭州化物所的ATC18反相色譜柱，填料：Sino ODSAP，柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5μm，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，根據(jù)出峰面積計(jì)算出RA含量及總苷含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Execl 2003和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，利用方差分析和多重比較對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，并進(jìn)一步運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度[11]進(jìn)行分析，具體如下。

1.4.1 確定參考序列X0及無(wú)量綱化處理

運(yùn)用灰色系統(tǒng)理論，把所有供試的7份種質(zhì)資源作為一個(gè)灰色系統(tǒng)。各品種為系統(tǒng)中的一個(gè)因素。把品種選育目標(biāo)與優(yōu)良品種的上限結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建一個(gè)理想品種，以理想品種的各性狀指標(biāo)構(gòu)成參考數(shù)列，記為X0，試驗(yàn)品種的各性狀值為比較數(shù)列，記為Xi（k）（i=1，2，3，…，m；k=1，2，3，…，n），其中m為參試品種數(shù)，本研究中m為7，n為性狀數(shù)量，本研究中n為13。

采用初值化方法，即Xi數(shù)值分別除以X0，將原始數(shù)據(jù)無(wú)量綱化處理。

1.4.2 計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)

關(guān)聯(lián)系數(shù)公式如下：

1.4.3 計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度

等全關(guān)聯(lián)度公式（2）、權(quán)重系數(shù)公式（3）、加權(quán)關(guān)聯(lián)度公式（4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試甜葉菊種質(zhì)材料各指標(biāo)分析

由表1可知，7個(gè)甜葉菊品種的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)不同。通過(guò)顯著性分析可知，各組間株高差異不顯著，且株高變化范圍在65.00～80.33 cm；主莖最粗的為GY-27（X6），最細(xì)的為GY-24（X3），兩者差異顯著；一級(jí)分枝數(shù)最多的為GY-25（X4），為28.67個(gè)；葉長(zhǎng)變化范圍在5.20～7.33 cm之間；葉厚變化范圍在0.43～0.87 mm之間；單株鮮葉產(chǎn)量和單株干葉產(chǎn)量最高的均為GY-23（X2），分別達(dá)240.70 g/株和66.54 g/株；葉莖比的平均值為1.00～1.44，干葉公頃產(chǎn)量最高的為GY-23（X2），可達(dá)7 984.8 kg/hm2，顯著高于GY-27（X6）的4 488.0 kg/hm2。

甜葉菊干葉中糖苷分析結(jié)果如圖1所示，GY-27（X6）的RA含量明顯低于其余各品種，其余6個(gè)品種間RA含量不顯著；RA/總苷比值最高的為GY-26（X5），最低的為GY-27（X6）；RA公頃產(chǎn)量最高的為GY-23（X2），最低的為GY-27（X6），兩者之間差異顯著。

表1 7個(gè)甜葉菊品種的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量Table1 Theagronomic character s and yield of 7 stevia varieties

圖1 7個(gè)甜葉菊品種的RA含量Fig. 1 The RA content of 7 stevia varieties

2.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.2.1 構(gòu)建參考序列

本研究以選擇出高產(chǎn)、高RA含量的甜葉菊品種為研究目標(biāo)，參考數(shù)列X0的株高、主莖粗、一級(jí)分枝數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚、單株鮮葉產(chǎn)量、單株干葉產(chǎn)量、葉莖比、干葉產(chǎn)量、RA含量、RA/總苷及RA公頃產(chǎn)量，選用7份材料中最大測(cè)定值，構(gòu)成最優(yōu)指標(biāo)集

2.2.2 無(wú)量綱化處理，并求絕對(duì)差值

各指標(biāo)測(cè)定值的計(jì)量單位和量綱不同，不能直接進(jìn)行比較，因此需要對(duì)各營(yíng)養(yǎng)成分的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化標(biāo)準(zhǔn)處理（表2），使數(shù)值壓縮在[0，1]區(qū)間內(nèi)，從而具有同等性和可比性[11]。

原始數(shù)據(jù)無(wú)量綱化后，求得7個(gè)材料Xi與參考數(shù)列X0的絕對(duì)差值（表3），其中二級(jí)最小差值為0，二級(jí)最大差值為0.8179。

表2 數(shù)據(jù)的無(wú)量綱化處理Table 2 Standard transformed data

2.2.3 求關(guān)聯(lián)系數(shù)

7份甜葉菊種質(zhì)材料與參考序列之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)根據(jù)公式（1）計(jì)算可得，結(jié)果如表4所示。

表3 X0與Xi的絕對(duì)差值Table3 Absolutedifferences between X0 and Xi

表4 7個(gè)甜葉菊品種與參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table4 Correlation coefficients of 7 stevia varieties and reference number series

2.2.4 計(jì)算關(guān)聯(lián)度

由灰色關(guān)聯(lián)度理論中的關(guān)聯(lián)度分析原則[12]可知，參考序列的產(chǎn)量和品質(zhì)最佳，甜葉菊各品種與參考序列的關(guān)聯(lián)度越大，其綜合性狀就越好。根據(jù)等權(quán)關(guān)聯(lián)度的公式（2）計(jì)算得出等權(quán)排序，等權(quán)關(guān)聯(lián)度由大到小依次是GY-23（X2）＞GY-26（X5）＞GT-1（X1）＞GY-25（X4）＞GY-27（X6）＞GY-28（X7）＞GY-24（X3），等權(quán)關(guān)聯(lián)度反映的是各測(cè)定性狀對(duì)綜合表現(xiàn)具有同等貢獻(xiàn)[13]，而在甜葉菊品種綜合表現(xiàn)中，每個(gè)性狀指標(biāo)對(duì)綜合表現(xiàn)的貢獻(xiàn)不同，因此采用加權(quán)關(guān)聯(lián)度進(jìn)行再次評(píng)價(jià)，利用權(quán)重系數(shù)公式（3）計(jì)算出各測(cè)定性狀所占的比重，然后根據(jù)公式（4）算得加權(quán)關(guān)聯(lián)度，結(jié)果如表5所示，加權(quán)關(guān)聯(lián)度的排序和等權(quán)關(guān)聯(lián)度完全一致，這使得分析結(jié)果更為準(zhǔn)確，從而全面地反映了各品種在河西地區(qū)的表現(xiàn)優(yōu)劣，為新品種選育提供指導(dǎo)。

表5 7個(gè)甜葉菊品種與參考序列的關(guān)聯(lián)度Table5 Grey correlative degree among7 stevia varieties and reference number series

3 討論與結(jié)論

利用灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)不同甜葉菊品種進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，克服樣本數(shù)量小、數(shù)據(jù)不充分的困難，解決僅依靠產(chǎn)量或品質(zhì)進(jìn)行單一因素評(píng)價(jià)的問(wèn)題[14]，保證研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域及綜合評(píng)價(jià)方面得到了廣泛應(yīng)用[15]。

就評(píng)價(jià)因素而言，影響甜葉菊品種優(yōu)劣的因素主要有產(chǎn)量和品質(zhì)[16]，產(chǎn)量因素中葉片產(chǎn)量最為重要，甜葉菊葉片中含有多種不同的二萜糖苷類物質(zhì)[2]，每種物質(zhì)的含量、口感和甜度都各不一樣，其中RA市場(chǎng)需求量大，因此，在品質(zhì)因素中選用RA糖苷為評(píng)價(jià)因素，而同一植株不同葉位的含量存在差異，以植株中部含量最高[17]，因此取樣部位一致，樣品才具有代表性。

甜葉菊種質(zhì)RA含量的測(cè)定包括提取、分離和檢測(cè)3個(gè)步驟。每一個(gè)步驟都會(huì)影響最終結(jié)果。在提取葉片中的RA時(shí)，提取方法不同也會(huì)影響RA含量，如葉片的干燥方式，含水量以及提取液等[18-19]。液相色譜法是精確快速測(cè)定甜葉菊葉片中甜菊糖苷含量的理想方法[20-21]，甜菊糖苷的出峰時(shí)間會(huì)隨著流動(dòng)相中有機(jī)試劑比例和流速的改變而改變，但不同甜菊糖苷的出峰順序只決定于色譜柱的類型[22]，同一樣品在不同的條件下檢測(cè)結(jié)果不同，而本研究所有樣品均是在同一條件下檢測(cè)，RA出峰時(shí)間約在7.6 min，因此可以進(jìn)行糖苷比較。本研究對(duì)7個(gè)甜葉菊品種采用灰色關(guān)聯(lián)度分析綜合評(píng)價(jià)得出，GY-23、GY26和GT-1分別位列第一、第二和第三位，可以作為甘肅河西地區(qū)甜葉菊新品種選育的優(yōu)良種質(zhì)資源，在今后的研究中作為重點(diǎn)。而GY-24、GY-25、GY-27、GY-28可以作為研究其他性狀的種質(zhì)材料，如蛇菊苷（STV）或萊鮑迪苷C（RC）等，為市場(chǎng)所需的專用品種建立種質(zhì)資源庫(kù)。為此，本研究對(duì)甜葉菊新品種選育提供了一定的理論指導(dǎo)，為大面積甜葉菊種植提供了參考依據(jù)。