史新玉 安治國(guó) 孫樂(lè)樂(lè) 徐斌△ 母代斌△ 傅松年△ 胡紅星△ 羅曉 杜雯閆萍 靳路 聶丹 考爾沙爾·艾力木 師詠勇 伊琦忠△○☆

眾多研究認(rèn)為精神分裂癥（schizophrenia）是一種多基因、復(fù)雜的遺傳性疾病[1-3]，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因及位點(diǎn)與該疾病發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[4]?，F(xiàn)有研究揭示，蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3A（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A,PPP1R3A）基因是中國(guó)漢族人群精神分裂癥遺傳易感基因之一，而針對(duì)西方人群精神分裂癥的研究未發(fā)現(xiàn)其關(guān)聯(lián)性[4]。中國(guó)維吾爾族人群是比較典型的東西方“混血”人群[5]，早前已有研究報(bào)道中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥有其獨(dú)特的臨床特征[6]和遺傳易感性[7-8]。目前尚未見(jiàn)關(guān)于PPP1R3A基因與中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥關(guān)聯(lián)性的研究。為此，本研究采用靶向捕獲二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)中國(guó)維吾爾族精神分裂癥患者PPP1R3A基因外顯子區(qū)域，旨在了解該基因與該人群精神分裂癥病因?qū)W關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象患者組來(lái)自2010-2018年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及新疆維吾爾族自治區(qū)其他精神衛(wèi)生機(jī)構(gòu)住院的維吾爾族精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②維吾爾族，三代以上均居住在新疆維吾爾族自治區(qū)；③相互間無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重軀體疾??；②存在物質(zhì)依賴或物質(zhì)成癮；③妊娠期或哺乳期婦女；④患有其他精神疾病或精神發(fā)育遲滯。共收集528例患者，男性308例，女性220例；年齡11～81歲，平均（38.09±11.19）歲。

對(duì)照組來(lái)自2017-2018年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)精神疾病史及家族史；②身體健康；③維吾爾族，三代以上均居住在新疆維吾爾族自治區(qū)；④與患者組及相互間無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。共收集576名對(duì)照，男性330名，女性246名；年齡13～84 歲，平均（37.54±12.06）歲。 患者組與對(duì)照組性別分布（χ2=0.123,P=0.726）、年齡（t=0.716,P=0.486）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有納入對(duì)象或其監(jiān)護(hù)人均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 自制一般情況調(diào)查表，收集入組被試的人口學(xué)資料，由兩名主治以上職稱的精神科醫(yī)師對(duì)患者及監(jiān)護(hù)人詢問(wèn)病史，采用適于DSM-Ⅳ的結(jié)構(gòu)式臨床訪談（structured clinical interview for DSM-Ⅳ,SCID）進(jìn)行定式精神檢查并診斷，用陽(yáng)性與陰性癥狀量表（positive and negative symptoms scale,PANSS）評(píng)定患者病情嚴(yán)重程度。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究對(duì)象的肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，-20°C冰箱保存，采用血液基因組DNA提取試劑盒 （Tiangen Biotech Co.Ltd,Beijing,China）提取外周血 DNA，用 NanoDropl000分光光度計(jì)對(duì)DNA樣本濃度、純度進(jìn)行測(cè)定。樣本需達(dá)到吸光度A260/A280大于1.65，濃度高于15 ng/μL，不符合要求的重新提取。提取的DNA放置于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PPP1R3A基因外顯子區(qū)域靶向捕獲及測(cè)序采用多重PCR靶向捕獲二代測(cè)序技術(shù)擴(kuò)增和檢測(cè)PPP1R3A基因外顯子區(qū)域DNA。①配置Phu sion PCR 反應(yīng)體系，包括 Phusion HF buffer（5×）2 μL、10 mmol/L （each）dNTP mix 0.2 μL、10 × primer mix-F 0.1 μL、10× primer mix-R 0.1 μL、Nuclease-free Water 4.4 μL、Phusion Hot Start II polymerase （2 U/μL）0.2 μL、3 μL 基因組 DNA， 快速離心后，在PCR儀按照PCR反應(yīng)條件所要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)；②將上述PCR反應(yīng)液中加入1 μL Exonulease（NEB）吹打混合均勻繼續(xù)在 PCR儀上根據(jù)設(shè)定條件進(jìn)行反應(yīng)，1.0×AMPure磁珠純化，70%的乙醇洗脫兩遍；③配置第二次PCR反應(yīng)體系， 樣品 DNA 21 μL，Primer i5 2 μL，Primer i7 2 μL，2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μL，設(shè)置PCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)；④樣品各取5 μL合并，取100 μL進(jìn)行純化；⑤終產(chǎn)物經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOne進(jìn)行片段大小及濃度的檢測(cè)，最后終產(chǎn)物使用二代高通量測(cè)序儀Illumina HiSeq X Ten（美國(guó)Illumina公司）測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 在開(kāi)始序列比對(duì)之前，使用FASTQC質(zhì)控軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查和預(yù)處理，隨后運(yùn)用 BWA軟件（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）比對(duì)和定位到參考序列上（GRCh37/Hg19），隨后使用 Picard軟件、GATK 軟件（https：//software.broadinstitute.org/gatk/）檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)單核苷酸變異（single nucleotide variation,SNV）和插入缺失突變（insertions and deletions,Indels）等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，用ANNOVAR軟件將突變位點(diǎn)注釋到特定的數(shù)據(jù)庫(kù) （1000 Genome,ESP6500,ExAC,SIFT/PolyPhen）中，對(duì)得到的突變信息進(jìn)行過(guò)濾，獲得變異位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組年齡、性別比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，男女患者PANSS量表評(píng)分比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。利用PLINK軟件平臺(tái)，患者組與對(duì)照組基因分布頻率的Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，兩組間等位基因和基因型分布比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各性別患者病情嚴(yán)重程度患者組中男性和女性的PANSS陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀、一般精神病理學(xué)癥狀量表分及總分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表 1）。

表 1 男性與女性患者PANSS量表評(píng)分

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序，共獲得PPP1R3A基因rs1800000、rs1799999、rs8192686等3個(gè)變異位點(diǎn)。各位點(diǎn)在兩組中分布符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本具有一定的代表性。

2.3 PPP1R3A基因rs1800000位點(diǎn)等位基因及基因型頻率患者組與對(duì)照組間等位基因（χ2=13.305,P=0.001）和基因型（χ2=19.312,P=0.001）頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對(duì)照組間等位基因（χ2=6.874,P=0.009）和基因型（χ2=11.706,P=0.003）頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；女性患者組與女性對(duì)照組間等位基因（χ2=6.422,P=0.011）和基因型（χ2=8.048,P=0.018）頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

表2 患者組與對(duì)照組及不同性別亞組rs1800000位點(diǎn)等位基因與基因型頻率

2.4 PPP1R3A基因rs1799999位點(diǎn)等位基因及基因型頻率患者組與對(duì)照組間等位基因（χ2=1.006,P=0.316）和基因型（χ2=1.523,P=0.467）頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對(duì)照組間等位基因（χ2=0.002,P=0.963）和基因型（χ2=1.244,P=0.537）頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；女性患者組與女性對(duì)照組間等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.188,P=0.139），基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.564,P=0.038）（見(jiàn)表3）。

2.5 PPP1R3A基因rs8192686位點(diǎn)等位基因及基因型頻率患者組與對(duì)照組間等位基因（χ2=1.190,P=0.275）和基因型（χ2=1.203,P=0.548）頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按性別分亞組，男性患者組與男性對(duì)照組間等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.625,P=0.032），基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.697,P=0.096）；女性患者組與女性對(duì)照組間等位基因（χ2=0.515,P=0.473）和基因型（χ2=0.673,P=0.714）頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表4）。

表3 患者組與對(duì)照組及不同性別亞組rs1799999位點(diǎn)等位基因與基因型頻率

表4 患者組與對(duì)照組及不同性別亞組rs8192686位點(diǎn)等位基因與基因型頻率

3 討論

PPP1R3A基因編碼骨骼肌特異糖原靶向調(diào)節(jié)亞基，該基因位于染色體7q31.1，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。PPP1R3A基因或蛋白質(zhì)序列改變與2型糖尿病等多種代謝性疾病相關(guān)[9-11]，研究也發(fā)現(xiàn)該基因與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)性。LI等[4]納入36180名研究對(duì)象，進(jìn)行中國(guó)漢族人群精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study,GWAS）及驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合精神疾病基因組聯(lián)盟（Psychiatric Genomics Consortium,PGC2）的歐洲樣本數(shù)據(jù)，開(kāi)展大樣本跨種族分析以及精細(xì)定位研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因與中國(guó)漢族精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)性，而在歐洲精神分裂癥人群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其關(guān)聯(lián)性。

本研究發(fā)現(xiàn)PPP1R3A基因rs1800000位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布在中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥和對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示該基因位點(diǎn)可能是中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥致病基因及位點(diǎn)之一；而rs1799999位點(diǎn)可能與中國(guó)維吾爾族女性精神分裂癥的發(fā)病有關(guān)聯(lián)性；該基因上的rs8192686位點(diǎn)C等位基因可能與中國(guó)維吾爾族男性精神分裂癥發(fā)病相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明PPP1R3A基因可能是中國(guó)漢族和中國(guó)維吾爾族精神分裂癥人群共同致病基因之一?；蛟诓煌巳杭暗赜蛑写嬖谶z傳異質(zhì)性，中國(guó)維吾爾族人群遺傳學(xué)特征介于中國(guó)漢族人群和歐洲人群之間[5]，既往研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)維吾爾族精神分裂癥患者和中國(guó)漢族精神分裂癥患者在臨床表現(xiàn)和遺傳學(xué)上存在差異[6,12-13]，提示臨床和基礎(chǔ)研究中應(yīng)給予關(guān)注。

綜上，PPP1R3A基因可能是中國(guó)漢族和中國(guó)維吾爾族精神分裂癥的共同致病基因之一。本次研究仍存在一些不足，如未能對(duì)新發(fā)現(xiàn)的rs1800000、rs1799999、rs8192686基因位點(diǎn)開(kāi)展進(jìn)一步蛋白組學(xué)及功能方面的研究。未來(lái)需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)結(jié)合蛋白組學(xué)及功能學(xué)研究，更深入地探討PPP1R3A基因在中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥病因及發(fā)病機(jī)制中的作用。