去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

董 迪，毛 璐，宋 菲，張 威，甄健存（北京積水潭醫(yī)院，北京 100035）

去甲萬(wàn)古霉素是我國(guó)研制生產(chǎn)的糖肽類抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理性質(zhì)和抗菌作用與萬(wàn)古霉素相似，但治療成本明顯低于萬(wàn)古霉素。由于萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素對(duì)耐藥金黃色葡萄糖球菌和表皮葡萄球菌感染有很好的療效，且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此深受臨床重視，實(shí)際應(yīng)用中常需監(jiān)測(cè)血藥濃度。測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度的方法主要為高效液相色譜法和免疫法。采用高效液相色譜法檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度靈敏度高、專一性好，但樣本處理方法復(fù)雜且測(cè)量速度慢，不符合醫(yī)院監(jiān)測(cè)血藥濃度的實(shí)際情況，而目前市場(chǎng)上沒有專門針對(duì)去甲萬(wàn)古霉素開發(fā)的檢測(cè)試劑盒。因此研究一種適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的方法十分必要。我院目前使用的血藥濃度檢測(cè)儀器為德國(guó)西門子公司的Viva-E 血藥濃度分析系統(tǒng)，檢測(cè)方法為酶放大免疫法（enzyme- multiplied immunoassay technique，EMIT），檢測(cè)原理是基于抗原（萬(wàn)古霉素）與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體從而由酶活力反映抗原濃度。目前臨床常用的糖肽類抗菌藥物有萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素、替考拉寧，均具有相似的結(jié)構(gòu)，其中萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素在結(jié)構(gòu)上僅相差一個(gè)甲基，萬(wàn)古霉素抗體可能會(huì)與抗原結(jié)構(gòu)相似的去甲萬(wàn)古霉素分子結(jié)合，從而利用相同原理檢測(cè)其濃度。

1 資料與方法

1.1 主要儀器

Viva-E 藥物濃度檢測(cè)儀（德國(guó)西門子公司）、10AT 高效液相分析系統(tǒng)（日本島津公司）、Inertsil ODS-SP 色譜柱（日本島津公司，4.6 mm×250 mm）、Academic 超純水儀（Millipore 公司）、TDZ5-W S 離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、Research plus移液器（Eppendorf公司，100 ～ 1000 μL、20 ～ 200 μL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

去甲萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，規(guī)格：150 mg，批號(hào)：130338-200303）、替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格：100 mg，批號(hào)：130374-201002）、甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：500 mL，批號(hào)：20170303）、磷酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：500 mL，批號(hào)：20170103）、三乙胺（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：500 mL，批號(hào)：20140728）、磷酸二氫鉀（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：500 g，批號(hào)：20140627）、萬(wàn)古霉素檢測(cè)試劑（酶放大免疫測(cè)定法，德國(guó)西門子公司，國(guó)械注進(jìn)20162400276，批號(hào)：J5）、萬(wàn)古霉素檢測(cè)定標(biāo)液（德國(guó)西門子公司，國(guó)械注進(jìn)20162400298，批號(hào)：J3）、治療藥物監(jiān)測(cè)質(zhì)控物（水平1，美國(guó)Bio-Rad公司，國(guó)械注進(jìn)20122401399，批號(hào)：57341）、治療藥物監(jiān)測(cè)質(zhì)控物（水平2，美國(guó)Bio-Rad公司，國(guó)械注進(jìn)20122401399，批號(hào)：57342）、實(shí)驗(yàn)用水為Academic超純水儀制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用EMIT法檢測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度，考察濃度為20 μg·mL-1去甲萬(wàn)古霉素和替考拉寧是否能夠?qū)z測(cè)試劑進(jìn)行有效響應(yīng)，將具有有效響應(yīng)的品種與高效液相檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，并對(duì)日間差異、定量下限等項(xiàng)目進(jìn)行初步研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬(wàn)古霉素檢測(cè)試劑對(duì)20 μg·mL-1去甲萬(wàn)古霉素及20 μg·mL-1替考拉寧的響應(yīng)情況

用空白血清分別配制去甲萬(wàn)古霉素、替考拉寧待測(cè)樣本，每種藥品各制備3份樣本，濃度均為20 μg·mL-1。運(yùn)用藥物濃度檢測(cè)儀萬(wàn)古霉素濃度檢測(cè)模塊對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量，3 份萬(wàn)古霉素樣本檢測(cè)結(jié)果分別為：20.4、21.0、19.5 μg·mL-1；3 份替考拉寧樣本檢測(cè)結(jié)果分別為：1.4、0.8、1.6 μg·mL-1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推斷，對(duì)于萬(wàn)古霉素檢測(cè)試劑，去甲萬(wàn)古霉素具有較好的響應(yīng)，替考拉寧響應(yīng)微弱。

2.2 EMIT法與HPLC法檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的差異

參照Viva-E 藥物濃度檢測(cè)儀中萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立流程，用空白血清分別配置去甲萬(wàn)古霉素濃度為0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的樣品作為定標(biāo)液，由藥物濃度檢測(cè)儀自動(dòng)模擬標(biāo)準(zhǔn)曲線，用空白血清配置去甲萬(wàn)古霉素濃度為4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的樣本并對(duì)其進(jìn)行濃度檢測(cè)，每個(gè)濃度樣本平行制備3 個(gè)待測(cè)，平行檢測(cè)兩天（D1、D2）。為比較EMIT法與HPLC法的差別，我們參照EMIT法的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，用高效液相色譜法，對(duì)0、5、10、20、30、50 μg·mL-1的樣品作為定標(biāo)液，用外標(biāo)法對(duì)4、8、12、16、24、28、32、36、40、44、48 μg·mL-1的樣本進(jìn)行濃度檢測(cè)，每個(gè)濃度樣本平行制備3 個(gè)待測(cè)。流動(dòng)相為磷酸二氫鉀緩沖液∶甲醇（80∶20）等濃度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，檢驗(yàn)結(jié)果見表1。EMIT法擬合曲線為二元三次方程，具體如下：Y = -10-8X3- 6×10-5X2+ 0.006 5 X + 0.272 9，R2= 0.999 4（D1）、Y = - 3×10-7X3- 3×10-5X2+ 0.006 X + 0.273 7，R2 = 0.999 8（D2）；HPLC法擬合曲線為二元一次方程：Y = 5 378.8 X + 953.03，R2 = 0.998 7。

將樣本用HPLC法及兩日EMIT法所測(cè)結(jié)果回收率進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)，考察兩種方法是否具有差異，結(jié)果顯示P 值分別為0.467 8、0.342 0，均大于0.05，表明兩種方法所得結(jié)果回收率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 EMIT 法檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的日內(nèi)及日間差異

12組不同濃度樣品，每組平行制備3個(gè)樣本待檢測(cè)，應(yīng)用EMIT法、HPLC法分別檢測(cè)樣本，回收率均在85% ～ 115%之間，與標(biāo)準(zhǔn)值差異均小于15%，各組間CV均小于15%，具體結(jié)果見表2。

將EMIT 法兩日所測(cè)樣本結(jié)果回收率進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)考察日間差異，結(jié)果P 值為0.603 9，大于0.05，表明兩種方法日間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 EMIT法檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的定量下限

低濃度樣本組中，C、D、E、F組CV小于15%，僅F組各樣本回收率在85% ～ 115%，其他各組均出現(xiàn)過(guò)偏差大于±15%的情況，因此本研究初步建議檢測(cè)下限應(yīng)≥3.0 μg·mL-1。

表1 去甲萬(wàn)古霉素不同濃度樣本運(yùn)用EMIT法與HPLC法的檢測(cè)結(jié)果. n = 3Tab 1 Results of norvancomycin plasma concentration in different samples detected by EMIT and HPLC. n = 3

表2 低濃度樣本EMIT法檢測(cè)情況Tab 2 Results of low concentration samples detected by EMIT

3 討論

3.1 可利用免疫法試劑盒的交叉反應(yīng)檢測(cè)抗原結(jié)構(gòu)類似物

已有研究表明，市售免疫法試劑盒與部分抗原結(jié)構(gòu)類似物存在交叉反應(yīng)，如使用地高辛試劑盒檢測(cè)杠柳毒苷[1]，使用慶大霉素試劑盒檢測(cè)依替米星[2]。酶放大免疫法原理是樣品中萬(wàn)古霉素和帶有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的萬(wàn)古霉素（試劑1）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體（試劑2），通過(guò)檢測(cè)酶活性下降程度來(lái)反映樣品中的萬(wàn)古霉素濃度。根據(jù)我國(guó)藥典中《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，配體結(jié)合分析方法應(yīng)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，以考察結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期合用藥物對(duì)方法的干擾。從另一個(gè)角度看，我們也可以利用其特異性方面的缺陷，來(lái)考察該方法是否可用于結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)的濃度檢測(cè)。

3.2 EMIT法適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)患者去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度

由于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素機(jī)制用途相同，以原型經(jīng)腎臟排泄在體內(nèi)幾乎不代謝，因此臨床一般情況下在同一待測(cè)樣本中不會(huì)彼此干擾。本研究結(jié)果顯示，使用我院Viva-E 藥物濃度檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素線性較好，日間差異處于《中國(guó)藥典》要求范圍內(nèi)，同時(shí)考慮到免疫法快速、靈敏、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，EMIT 法適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)患者去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，除了HPLC[3]、UPLC[4]等常用液相色譜技術(shù)，LC-MS/MS[5]、UPLC-MS/MS[6]等檢測(cè)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的液質(zhì)聯(lián)用方法相繼開發(fā)，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以根據(jù)實(shí)際情況選用合適的檢測(cè)方法。

3.3 不同檢測(cè)方法間去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度的差異探討

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未顯示HPLC法與EMIT法檢驗(yàn)去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度存在顯著性差異，在PubMed、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)、數(shù)字化期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到相關(guān)文獻(xiàn)1篇，其結(jié)果表明兩種方法的測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]，與本研究結(jié)果一致。在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索類似血藥濃度檢測(cè)方法學(xué)比較的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有研究顯示檢測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度時(shí)，HPLC法與熒光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）可能存在顯著性差異[8-9]。FPIA 與EMIT 均為目前常用的基于免疫學(xué)原理的藥物濃度檢測(cè)方法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在≥20 μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組中，也存在著EMIT 法測(cè)得值較HPLC法測(cè)得值偏高的問題，選取≥20 μg·mL-1區(qū)間數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，EMIT、HPLC 測(cè)得值在上述區(qū)間存在顯著性差異（EMIT法D1、D2與HPLC法標(biāo)準(zhǔn)偏差P值分別為0.000 012 3、0.000 365 4，均小于0.05），其原因可能為代謝降解產(chǎn)物的干擾所致[10]。因此，EMIT 法與HPLC 法是否存在差異可能受數(shù)據(jù)采集區(qū)間及樣本數(shù)量影響，還需要更多真實(shí)世界的數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。

3.4 需要更多去甲萬(wàn)古霉素循證研究指導(dǎo)臨床用藥

目前利用去甲萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)缺乏權(quán)威的藥代/藥效動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)及專業(yè)指南支持。而萬(wàn)古霉素有更多的臨床、實(shí)驗(yàn)、循證證據(jù)，近年來(lái)推出了多部指南，對(duì)臨床合理用藥提供了有效幫助。去甲萬(wàn)古霉素與萬(wàn)古霉素抗菌譜相似，治療效果相當(dāng)，而去甲萬(wàn)古霉素在抗感染應(yīng)用中的治療成本明顯低于萬(wàn)古霉素[11]。去甲萬(wàn)古霉素為我國(guó)主要研發(fā)生產(chǎn)的抗菌藥物，具有很好的市場(chǎng)前景和臨床需求，且在醫(yī)?？刭M(fèi)日趨嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)情況下，優(yōu)勢(shì)明顯。因此，臨床需要科研及臨床工作者提供更多的數(shù)據(jù)，應(yīng)用血藥濃度監(jiān)測(cè)技術(shù)，指導(dǎo)臨床用藥，保障患者用藥安全。