白維曉，吳光麗，王 毅，宋鵬飛，馬永凱，吳麗君，魏云林，季秀玲，李海燕*

1.昆明理工大學(xué)，昆明市呈貢區(qū)景明南路727號(hào) 650500

2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，昆明市盤(pán)龍區(qū)世博路6號(hào) 650224

煙葉經(jīng)初烤、復(fù)烤后，仍存在吸濕性強(qiáng)、燃燒性差、自然芳香不足、吃味苦澀等特點(diǎn)，需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的醇化，才能滿(mǎn)足卷煙生產(chǎn)要求［1］。自然醇化是改善煙葉香味、提高煙葉品質(zhì)和可用性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-2］。研究表明，微生物在煙葉自然醇化過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，主要是通過(guò)產(chǎn)生生物酶類(lèi)來(lái)增強(qiáng)生物大分子的轉(zhuǎn)化、促進(jìn)致香成分的產(chǎn)生和積累、降低煙葉中的有害物質(zhì)［2-3］。此外，微生物還能顯著縮短醇化時(shí)間，提高卷煙生產(chǎn)效率［4-8］。相反，如果煙葉醇化過(guò)程中某些腐霉微生物過(guò)度繁殖，則會(huì)導(dǎo)致煙葉霉變，甚至產(chǎn)生有害物質(zhì)，從而降低卷煙品質(zhì)［9-10］。因此，掌握煙葉醇化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，是控制卷煙質(zhì)量、揭示醇化機(jī)理、實(shí)現(xiàn)人為干預(yù)煙葉醇化及提高醇化效率的關(guān)鍵，具有一定的理論和實(shí)用價(jià)值。

云南是我國(guó)最主要的煙葉產(chǎn)區(qū)，整體氣候適宜優(yōu)質(zhì)煙葉的生長(zhǎng)［11-14］。然而，較為分散的煙葉醇化地，導(dǎo)致了煙葉醇化時(shí)間、醇化品質(zhì)及其影響因素變得較為復(fù)雜。由于不同醇化地的環(huán)境條件不同，則導(dǎo)致醇化煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)不同，最終使煙葉的醇化品質(zhì)不同［15］。目前，關(guān)于云南不同倉(cāng)儲(chǔ)地、不同醇化時(shí)間K326復(fù)烤煙葉表面真菌群落結(jié)構(gòu)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，分析了K326復(fù)烤煙葉在云南不同倉(cāng)儲(chǔ)地（彌勒、曲靖、元江、楚雄）醇化期間煙葉表面可培養(yǎng)真菌的數(shù)量、種類(lèi)及其動(dòng)態(tài)變化，旨在為改進(jìn)煙葉醇化技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試的11份K326復(fù)烤煙葉樣品均為2014年紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司、紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司提供。分別為昆明WDC3F、WBBSF復(fù)烤煙葉，大理VCO2A復(fù)烤煙葉，楚雄VBO2S、VCO1S復(fù)烤煙葉，玉溪VCO2S、VBO2S復(fù)烤煙葉，紅河WBB1F、WDC3F復(fù)烤煙葉，曲靖WBBSF、WDC3F復(fù)烤煙葉。

1.2 復(fù)烤煙葉異地醇化

2015年4月，將11份K326復(fù)烤煙葉樣品分別送至曲靖、楚雄、彌勒和元江4個(gè)倉(cāng)儲(chǔ)地進(jìn)行自然醇化。煙葉自然醇化的倉(cāng)儲(chǔ)條件：曲靖年均溫度19.8℃、年均相對(duì)濕度58.23%；楚雄年均溫度20.5℃、年均相對(duì)濕度59.55%；彌勒年均溫度19.8℃、年均相對(duì)濕度73.30%；元江年均溫度24.4℃、年均相對(duì)濕度64.97%。每個(gè)倉(cāng)儲(chǔ)地同步采集醇化0、6、9、15和17個(gè)月的煙葉樣品。采集時(shí)間為2015年4、10月，2016年1、7、9月。每個(gè)倉(cāng)儲(chǔ)地每次采集11份樣品，共220份樣品。樣品采集后密封于無(wú)菌袋中。

1.3 可培養(yǎng)真菌的分離

用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）分離、培養(yǎng)煙葉表面真菌。PDA培養(yǎng)基成分：200 g新鮮馬鈴薯，20 g葡萄糖，1.2%～1.3%瓊脂粉，加水定容至l 000 mL。于121℃高壓蒸汽滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，用細(xì)菌過(guò)濾器分別將0.5 g/L青霉素和0.5 g/L硫酸鏈霉素加入培養(yǎng)基，混勻后倒入培養(yǎng)皿及試管中。

真菌的分離。在無(wú)菌條件下，取50片煙葉放到培養(yǎng)皿中，用剪刀將葉片剪成1 cm2的小葉片，隨機(jī)選取10片小葉片均勻貼在PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品貼3個(gè)PDA培養(yǎng)基，共計(jì)30片小葉片。將貼有小葉片的培養(yǎng)基于25℃下恒溫培養(yǎng)。當(dāng)小葉片周?chē)L(zhǎng)出真菌時(shí)，便將真菌挑至新鮮的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離、純化。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到PDA試管中，用于分類(lèi)鑒定和保存。

1.4 煙葉表面真菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和生長(zhǎng)速率將菌株分為不同的形態(tài)類(lèi)群。從每個(gè)形態(tài)類(lèi)群中隨機(jī)挑取3～5株進(jìn)行促孢培養(yǎng)（10～60 d）。產(chǎn)孢后，根據(jù)產(chǎn)孢方式、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)特征等確定菌株的分類(lèi)地位［16-18］。促孢培養(yǎng)后仍不產(chǎn)孢的菌株，根據(jù)菌落顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速率等將其劃分為不同的無(wú)孢類(lèi)群組。

1.4.2 分子鑒定

對(duì)于不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類(lèi)地位的菌株，通過(guò)18S rDNA序列比對(duì)來(lái)確定分類(lèi)地位［19-20］。用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取真菌基因組DNA，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得18S rDNA序列。擴(kuò)增引物為真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的18S rDNA送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列進(jìn)行比對(duì)，相似度＞99%則屬于同種菌株，相似度＞97%則屬于同屬菌株［21-22］。根據(jù)覆蓋率、相似度并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定真菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同倉(cāng)儲(chǔ)地醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌的數(shù)量及其動(dòng)態(tài)變化

從來(lái)自4個(gè)醇化地（曲靖、楚雄、彌勒、元江）的220份煙葉樣品中，共分離得到2 963株可培養(yǎng)真菌。由圖1可知，來(lái)自4個(gè)醇化地的煙葉表面真菌數(shù)量隨醇化時(shí)間的變化規(guī)律基本相同：下降-上升-下降-趨于平緩。在醇化17個(gè)月時(shí)，除彌勒地區(qū)真菌數(shù)量還在持續(xù)下降外，其他3個(gè)地區(qū)的真菌數(shù)量基本趨于平緩。整體上，曲靖、楚雄地區(qū)醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌在不同醇化時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量均非常接近，且高于元江和彌勒兩地（除醇化15個(gè)月時(shí)）。彌勒地區(qū)醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌的數(shù)量除在醇化9個(gè)月時(shí)略高于元江地區(qū)外，其余時(shí)間點(diǎn)均為最低。總之，曲靖和楚雄兩地醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌的數(shù)量最多且無(wú)較大差異，元江次之，彌勒最低。

圖1 4個(gè)醇化地不同醇化時(shí)間煙葉表面可培養(yǎng)真菌數(shù)量的變化Fig.1 Variations in quantity of culturable fungi on surface of tobacco leaves aging for different times in four areas

2.2 不同倉(cāng)儲(chǔ)地醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌的種類(lèi)及其動(dòng)態(tài)變化

結(jié)合形態(tài)特征及18S rDNA序列，共鑒定出39個(gè)屬（種）的真菌，但有5類(lèi)無(wú)法確定種屬（表1）。不同醇化時(shí)間、不同倉(cāng)儲(chǔ)地醇化煙葉表面的可培養(yǎng)真菌種類(lèi)不同。醇化6個(gè)月時(shí)，在彌勒地區(qū)醇化煙葉的表面分離到青霉屬真菌（Penicilliumspp.）和Phialophora cyclaminis真菌，而曲靖、元江、楚雄3個(gè)醇化地區(qū)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)；在元江地區(qū)醇化煙葉的表面分離到交鏈孢屬真菌（Alternariasp.）、糞殼菌（Sordariomycetessp.）和近緣毛殼菌（Chaetomium subaffine），而曲靖、彌勒、楚雄3個(gè)醇化地區(qū)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。醇化9個(gè)月時(shí)，在楚雄地區(qū)醇化煙葉的表面分離到枝孢屬真菌（Cladosporiumspp.）、小不整球殼屬真菌（Plectosphaerellasp.）和Helianthus annuus真菌，而曲靖、彌勒、元江3個(gè)醇化地區(qū)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。

根霉屬真菌（Rhizopusspp.）在不同醇化地、不同醇化時(shí)間點(diǎn)均有分布。隨醇化時(shí)間延長(zhǎng)，4個(gè)醇化地分離得到同種真菌的概率逐漸增大。醇化15個(gè)月時(shí)，4個(gè)醇化地均分離到Cercophora samala真菌；醇化17個(gè)月時(shí)，4個(gè)醇化地均分離到柄孢霉真菌（Podospora anserina）、Coniochaeta velutina真菌和球毛殼菌（Chaetomium globosum）。

醇化前，從樣品中共分離到3種真菌，隨醇化時(shí)間延長(zhǎng)，分離到的真菌種類(lèi)逐漸增多。相同醇化時(shí)間不同醇化地的煙葉，其真菌種類(lèi)存在一定差異。醇化6個(gè)月的真菌種類(lèi)：彌勒=元江＞曲靖＞楚雄；醇化9個(gè)月的真菌種類(lèi)：彌勒=楚雄＞元江＞曲靖；醇化15個(gè)月的真菌種類(lèi)：元江＞彌勒＞楚雄＞曲靖；醇化17個(gè)月的真菌種類(lèi)：元江=楚雄＞曲靖＞彌勒。總體來(lái)看，不同醇化時(shí)間4個(gè)醇化地的煙葉真菌種類(lèi)差異較大，醇化17個(gè)月后真菌種類(lèi)才較為接近。

同一醇化地?zé)熑~的真菌種類(lèi)也隨醇化時(shí)間的變化而變化。以彌勒地區(qū)為例，醇化6個(gè)月時(shí)，分離到7種真菌。與醇化前相比，相同種類(lèi)的真菌有2種，不同種類(lèi)的真菌有5種。醇化9個(gè)月時(shí)，分離到9種真菌，與醇化6個(gè)月相比，相同種類(lèi)的真菌有2種，不同種類(lèi)的真菌有7種。醇化15個(gè)月時(shí)，分離到13種真菌，與醇化9個(gè)月相比，相同種類(lèi)的真菌有4種，不同種類(lèi)的真菌有9種。醇化17個(gè)月時(shí)，分離到9種真菌，與醇化15個(gè)月時(shí)相比，相同種類(lèi)的真菌有4種，不同種類(lèi)的真菌有5種。

表1 4個(gè)醇化地不同醇化時(shí)間煙葉表面可培養(yǎng)真菌的種類(lèi)Tab.1 Species of culturable fungi on surface of tobacco leaves aging for different times in four areas

表1（續(xù)）

2.3 不同倉(cāng)儲(chǔ)地醇化煙葉表面可培養(yǎng)真菌的優(yōu)勢(shì)菌群

從圖2可知，4個(gè)醇化地不同醇化時(shí)間煙葉表面可培養(yǎng)真菌的優(yōu)勢(shì)菌群均為根霉屬真菌。在醇化前、醇化6個(gè)月、醇化9個(gè)月時(shí)，根霉屬真菌均占總真菌數(shù)目的90%以上。醇化9個(gè)月時(shí)，從曲靖地區(qū)醇化煙葉表面只分離到根霉屬真菌。在煙葉醇化期間，青霉屬真菌、曲霉屬真菌（Aspergillusspp.）、Cercophora samala真菌、Myrmaecium rubricosum真菌、Coniochaeta velutina真菌、枝孢屬真菌和柄孢霉真菌出現(xiàn)的頻率相對(duì)較高。

隨醇化時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)醇化地?zé)熑~表面可培養(yǎng)真菌的優(yōu)勢(shì)菌群（除根霉屬真菌外）也不同。以元江地區(qū)為例，醇化前除根霉屬真菌外無(wú)其他優(yōu)勢(shì)菌群，醇化6個(gè)月時(shí)曲霉屬真菌成為第二優(yōu)勢(shì)菌群，醇化9個(gè)月時(shí)除根霉屬真菌外無(wú)其他優(yōu)勢(shì)菌群，醇化15個(gè)月時(shí)優(yōu)勢(shì)菌群有枝孢屬真菌、青霉屬真菌和Cercophora samala真菌，醇化17個(gè)月時(shí)優(yōu)勢(shì)菌群有柄孢霉真菌、球毛殼菌和枝孢屬真菌。

圖2 4個(gè)醇化地不同醇化時(shí)間煙葉表面可培養(yǎng)真菌的組成Fig.2 Community of culturable fungi on surface of tobacco leaves aging for different times in four areas

3 討論

浦紹占［23］研究表明，溫濕度可影響煙葉表面的微生物活性，不同種類(lèi)微生物萌發(fā)生長(zhǎng)所需的環(huán)境條件不同，就導(dǎo)致在醇化過(guò)程中煙葉表面微生物種群結(jié)構(gòu)存在差異。云南K326復(fù)烤煙葉在不同地區(qū)的醇化過(guò)程中，元江和彌勒煙葉表面真菌數(shù)量均小于曲靖和楚雄。其中，曲靖和楚雄煙葉表面真菌數(shù)量在每個(gè)醇化時(shí)間點(diǎn)的差異很小，但與元江和彌勒兩地差異較大。從氣候特征來(lái)看，元江和彌勒的年均溫濕度與曲靖和楚雄均有較大差異，但曲靖和楚雄兩地較為相似，表明煙葉表面真菌數(shù)量與環(huán)境條件密切相關(guān)。

與前人研究結(jié)果［2-3，6，24-25］相似，4 個(gè)醇化地?zé)熑~表面真菌數(shù)量也呈“下降-上升-下降-趨于平緩”的趨勢(shì)。真菌數(shù)量的減少可能存在兩方面的原因：①由于醇化過(guò)程中煙葉含水量較低，從而抑制了真菌的生長(zhǎng)；②煙葉表面微生物之間存在生存競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致真菌數(shù)量減少［6，26］。

龔?。?7］研究表明煙葉表面微生物的種類(lèi)隨醇化時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化。本研究中，不同醇化時(shí)間點(diǎn)的不同醇化地?zé)熑~表面真菌種類(lèi)也存在差異，且隨醇化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。蘇加坤等［28］、邱立友等［29］研究發(fā)現(xiàn)煙葉表面的優(yōu)勢(shì)真菌為曲霉屬真菌。Welty等［30］發(fā)現(xiàn)陳化煙葉表面真菌主要有曲霉屬、青霉菌屬、鏈格孢屬、枝孢屬和毛殼菌屬，其中曲霉屬真菌含量最高。而本研究中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬為根霉屬真菌，與蘇加坤等［28］、邱立友等［29］、Welty 等［30］的研究結(jié)果不同。徐潔［31］用一種根霉屬真菌處理煙葉后發(fā)現(xiàn)，處理過(guò)的煙葉其香氣、香味更優(yōu)，并在煙葉中檢測(cè)出具有增香作用的化學(xué)物質(zhì)。因此，仍需對(duì)本研究中發(fā)現(xiàn)的大量根霉屬真菌進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

從220份云南K326復(fù)烤煙葉樣品（來(lái)自4個(gè)醇化地、不同醇化時(shí)間）中共分離、純化到2 963株可培養(yǎng)真菌。不同醇化地區(qū)煙葉表面真菌的數(shù)量隨醇化時(shí)間的變化呈“下降-上升-下降-趨于平緩”的趨勢(shì)。4個(gè)醇化地不同醇化時(shí)間的真菌種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)菌群具有差異，隨醇化時(shí)間的延長(zhǎng)真菌種類(lèi)不斷增加。根霉屬真菌是煙葉表面的優(yōu)勢(shì)菌群。