鄭慧廣，李鼎昀，落繼先

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

小鼠白血病細(xì)胞L1210來(lái)自小鼠淋巴細(xì)胞白血病，生長(zhǎng)速度快，增殖周期短，腫瘤細(xì)胞增殖比率高，對(duì)化療藥物敏感，已廣泛用于藥物細(xì)胞毒性及活性的篩選，目前構(gòu)建L1210白血病小鼠模型尚未普遍運(yùn)用[1]。以小鼠白血病細(xì)胞L1210細(xì)胞系為基礎(chǔ)，采用尾靜脈注射構(gòu)建小鼠白血病模型，可進(jìn)一步用于篩選有效的抗腫瘤藥物。本研究比較了以L1210細(xì)胞尾靜脈注射昆明小鼠或DBA/2小鼠的方法，明確了2種L1210細(xì)胞系小鼠白血病模型的生物學(xué)特性，為后期L1210細(xì)胞遷移的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路及其體內(nèi)遷移和浸潤(rùn)的研究，以及抗腫瘤藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4～5周齡雌性昆明小鼠購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重 20.3～27.2 g，平均 23.4±22.12 g；4～5周齡雌性DBA/2小鼠購(gòu)自中國(guó)輻射防護(hù)研究院，體重 18.7～20.7 g，平均 20.16±0.62 g；小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞L1210購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（ATCC，CCL-219）；高糖型DMEM（Gibco公司）；普通新生牛血清（生工生物工程股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（Eppendorf公司）；超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng)

培養(yǎng)液為高糖型DMEM，添加10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，隔天補(bǔ)液，隔天傳代。尾靜脈注射的L1210細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 小鼠飼養(yǎng)

將新采購(gòu)的小鼠事先飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，觀察小鼠狀態(tài)。小鼠飼養(yǎng)于干凈、通風(fēng)的環(huán)境中，普通飼料，室溫20～27℃，光線晝夜交替，所有小鼠自由攝食、飲水。

1.4 尾靜脈注射

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）和實(shí)驗(yàn)組（B組），每組5只，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射5×106L1210細(xì)胞，對(duì)照組尾靜脈注射等體積的PBS；將DBA/2小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）和實(shí)驗(yàn)組（D組），每組6只，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射5×106L1210細(xì)胞，對(duì)照組尾靜脈注射等體積的PBS。

1.5 發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

各組小鼠尾靜脈注射L1210細(xì)胞后，隔天測(cè)量并記錄小鼠體重，統(tǒng)計(jì)分析；隔天觀察并記錄小鼠的活動(dòng)情況；統(tǒng)計(jì)各組小鼠存活時(shí)間及其死亡率，統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 器官測(cè)量、稱重

昆明小鼠飼養(yǎng)56 d后，以頸椎脫臼法處死，取小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等臟器測(cè)量其最大直徑并稱重，統(tǒng)計(jì)分析。DBA/2小鼠飼養(yǎng)14 d后，記錄死亡率，統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

記錄數(shù)據(jù)，組內(nèi)多樣本均數(shù)的比較均采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 存活時(shí)間和體重變化

4組小鼠存活時(shí)間和體重變化見(jiàn)表1。A、B組小鼠存活時(shí)間比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A、B組小鼠體重變化比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C、D組小鼠存活時(shí)間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；C、D組小鼠體重變化比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 昆明小鼠和DBA/2小鼠對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組存活天數(shù)和體重變化（x±s）

2.2 發(fā)病特征

昆明小鼠注射L1210細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，小鼠活躍程度顯著下降，除此之外并無(wú)其他明顯的表面特征，且在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。DBA/2小鼠注射L1210細(xì)胞后，第7 d已出現(xiàn)死亡，瀕死的小鼠異常躁動(dòng)，首先會(huì)出現(xiàn)左后肢或右后肢單側(cè)偏癱，緊接著左右后肢或腰部以下截癱，行動(dòng)遲緩，之后腰部趨于弓形，最后死亡。DBA/2小鼠死亡率見(jiàn)圖1。

圖1 DBA/2小鼠對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組死亡率

2.3 臟器變化

昆明小鼠實(shí)驗(yàn)組脾臟明顯腫大（圖2），臟器重量顯著高于對(duì)照組（圖3）；實(shí)驗(yàn)組肺臟重量明顯高于對(duì)照組（圖3）；心臟和肝臟長(zhǎng)度及重量無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，昆明小鼠尾靜脈接種L1210白血病細(xì)胞后，心臟、肝臟、脾臟、肺臟等臟器均出現(xiàn)不同程度的色澤變化，其中以脾臟的色澤變化最為明顯（圖4）。

圖2 昆明小鼠尾靜脈接種L1210細(xì)胞后心臟、脾臟、肺臟、肝臟大小變化

圖3 昆明小鼠尾靜脈接種L1210細(xì)胞后心臟、脾臟、肺臟、肝臟重量變化

圖4 昆明小鼠對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組內(nèi)臟實(shí)圖

3 討論

白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，由造血系統(tǒng)發(fā)生惡性病變所致。白血病患者的骨髓或其他造血組織中的大量血細(xì)胞發(fā)生惡性克隆增殖，而正常的血細(xì)胞增殖被明顯抑制[2-3]。目前，除了少數(shù)白血病患者配型成功或通過(guò)骨髓移植治療以外，大部分患者的治療仍然依賴于化療和放療，但會(huì)迅速產(chǎn)生耐藥性，預(yù)后不容樂(lè)觀[4-5]。因此，白血病治療新策略一直是多年來(lái)的研究重點(diǎn)。細(xì)胞遷移是一種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)行為，是由趨化物刺激誘發(fā)或外界遷移信號(hào)引發(fā)的一種生命活動(dòng)[6-7]。細(xì)胞遷移這種動(dòng)態(tài)行為過(guò)程是腫瘤細(xì)胞向其他組織或器官發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。白血病細(xì)胞的心肌浸潤(rùn)在臨床上十分常見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外尸體解剖資料顯示，34%～66%的晚期白血病患者存在心臟浸潤(rùn)病理[8-9]。臟器浸潤(rùn)是導(dǎo)致白血病病情惡化和死亡的重要原因之一。研究顯示，部分急性淋巴細(xì)胞白血病患者伴隨肝臟、脾臟腫大，肝內(nèi)、脾內(nèi)多發(fā)性結(jié)節(jié)白血病浸潤(rùn)及肝脾功能異常[10-11]。雖然多數(shù)白血病患者胸片中未顯示病理，但研究結(jié)果表明白血病細(xì)胞肺部浸潤(rùn)發(fā)生率為24%～64%，患者胸部并發(fā)癥種類較多，如單側(cè)或雙側(cè)胸腔積水，但在不同病程時(shí)期或治療階段并發(fā)癥類型不盡相同[11-12]。異常的白血病細(xì)胞向心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織的遷移是白血病細(xì)胞向這類功能器官浸潤(rùn)的重要步驟，與白血病的復(fù)發(fā)有重要聯(lián)系。因此，研究并揭示白血病細(xì)胞遷移的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，對(duì)靶向治療白血病具有重要意義。

靜脈注射[13-14]、腹腔注射[15-19]、皮下接種[20-21]L1210細(xì)胞可制備白血病小鼠模型。少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道可以通過(guò)睪丸接種L1210細(xì)胞制備小鼠白血病細(xì)胞睪丸浸潤(rùn)模型[1]。尾靜脈注射操作較皮下注射、腹腔注射過(guò)程復(fù)雜，操作人員培訓(xùn)時(shí)間較長(zhǎng)，熟練程度要求較高。但在建立白血病動(dòng)物模型時(shí)，使白血病細(xì)胞在血液系統(tǒng)增殖更符合臨床病理，所以通過(guò)尾靜脈注射建立L1210白血病細(xì)胞小鼠模型是最接近臨床表現(xiàn)的造模方式[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)研究以L1210白血病細(xì)胞系為基礎(chǔ)，以昆明小鼠和DBA/2小鼠為宿主，構(gòu)建了L1210白血病小鼠模型，選取心臟、脾臟、肝臟、肺臟為研究指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，昆明小鼠尾靜脈接種L1210細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)并未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，體重變化不明顯，但與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)臟器官差異顯著，有明顯的脾臟及肺臟腫大；DBA/2小鼠尾靜脈注射L1210細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，第7 d出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，且瀕死小鼠外觀形態(tài)特征明顯異常。本實(shí)驗(yàn)明確了昆明小鼠和DBA/2小鼠2種L1210細(xì)胞系白血病模型的生物學(xué)特性，為后續(xù)L1210白血病細(xì)胞體內(nèi)遷移過(guò)程及侵襲部位的研究奠定了基礎(chǔ)，可以針對(duì)不同的研究目的和不同的實(shí)驗(yàn)周期來(lái)選擇合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>