李雪，朱勇，王丹楊，張耀超

西安醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021

牙周炎是一種局部牙周組織慢性炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為牙齦炎癥、出血、牙槽骨吸收、牙齒松動移位，嚴(yán)重者出現(xiàn)牙齒的自行脫落。牙周組織的重建和修復(fù)是長期以來口腔醫(yī)生廣泛關(guān)注的臨床重點和難點話題[1]。牙周膜細(xì)胞作為牙周組織中最主要的細(xì)胞群，由成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞等成分組成。牙周膜細(xì)胞具有向成骨和成牙骨分化的潛能，參與調(diào)節(jié)牙槽骨再生，因此被認(rèn)為是牙周疾病組織工程研究的重要種子細(xì)胞[2]。淫羊藿苷是一種小檗科淫羊藿屬植物，長期以來被用作補腎壯陽、抑菌消炎、抗衰老等用途[3-4]。近年來，淫羊藿苷也被證實能夠顯著抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展，對抗機體的骨衰退進程，并且能夠顯著加速局部的骨折和骨缺損修復(fù)[5-7]。但是，淫羊藿苷對于牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)活性以及成骨分化潛能的影響尚未被系統(tǒng)闡明。本研究旨在通過體外分離培養(yǎng)人原代牙周膜細(xì)胞，探索淫羊藿苷對于人牙周膜細(xì)胞增殖、分化以及成骨和破骨因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

淫羊藿苷、胰蛋白酶購于Sigma公司；胎牛血清、α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青/鏈霉素雙抗、無菌PBS購于Gibco公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測試劑盒、RIPA裂解液購于碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol購于Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒購于Pierce Chemical公司；OCN（骨鈣素）、Runx2（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）、BMP2（骨形態(tài)發(fā)生蛋白2）、RANKL（核因子κB受體活化因子配體）抗體購于Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于Bioworld公司；多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200）購于TECAN公司；紫外分光光度計（SmartSpec Plus）、PCR 儀（T100 thermal cycler）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot SD System）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc XR+）購于Bio-Rad公司；倒置顯微鏡（LEICA DM LA）購于Leica公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 3110）購于Thermo公司；低溫高速離心機（Sigma 3-18K）購于Sigma公司。

1.2 人牙周膜細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)

選取因正畸治療而需要拔除健康前磨牙的12～16歲青少年患者（無炎癥和齲齒），將其拔除的前磨牙進行原代牙周膜細(xì)胞的體外分離。將拔除的牙齒（＞20顆）立即浸沒于含青/鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，反復(fù)漂洗后，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用無菌眼科剪將組織剪碎成約0.5 mm×0.5 mm大小的組織塊，以陣列的形式均勻排布于培養(yǎng)瓶底部，在培養(yǎng)瓶中加入含10%青/鏈霉素、10%胎牛血清的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中12 h，隨后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。生長至第3～5代的細(xì)胞用于實驗。

1.3 淫羊藿苷干預(yù)與實驗分組

取第3～5代的原代牙周膜細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)的12 h后進行淫羊藿苷干預(yù)。整個實驗分為實驗組和對照組。實驗組細(xì)胞加入0.01 mg/L淫羊藿苷溶液，對照組加入單純成骨培養(yǎng)基。分別對細(xì)胞進行MTT細(xì)胞增殖檢測、堿性磷酸酶活性檢測，以及OCN、Runx2、BMP2和RANKL的基因和蛋白表達檢測。

1.4 基于MTT法的細(xì)胞增殖檢測

選取生長狀態(tài)良好的牙周膜細(xì)胞制成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，檢測前吸棄96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，用無菌PBS反復(fù)沖洗3～5次，隨后在96孔板的每孔內(nèi)加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，隨后在96孔板的各孔內(nèi)加入200 μL DMSO，37℃振蕩孵育15 min，用Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀測定每孔樣本的值。通過下式計算細(xì)胞抑制率：

1.5 堿性磷酸酶的檢測分析

用無鈣和鎂的Hanks液清洗細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，加入0.2%的Nonidet P-40重懸浮細(xì)胞，冰浴中超聲波裂解2 min，隨后用堿性磷酸酶活性測定試劑盒檢測牙周膜細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達含量。

1.6 成骨和破骨因子的基因表達檢測

在牙周膜細(xì)胞中加入異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，用異硫氰酸胍-酚氯仿法提取總RNA，再用Super-ScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶將提取的RNA合成為cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix進行real-time PCR測定選取的基因，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及GAPDH（引物序列見表1）。每個樣本上樣至96孔板的3個復(fù)孔中，用2-ΔΔCt法進行目的基因的定量分析，使用內(nèi)參基因β-actin對所有目的基因進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。每個樣本均重復(fù)3次real-time PCR，獲得并計算其平均值。

表1 用于本研究的real-time PCR引物序列

1.7 成骨和破骨因子的蛋白表達檢測

在牙周膜細(xì)胞中加入200 μL RIPA裂解液，待完全裂解后轉(zhuǎn)移至4℃離心30 min。用蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量。蛋白經(jīng)煮沸變性處理后進行電泳實驗。配制10%的下層Tris-甘氨酸-SDS分離膠和5%的上層壓縮膠，加入新鮮的電泳緩沖液，按照每孔40 μg蛋白提取物上樣，在30 mA恒流條件下電泳。根據(jù)marker蛋白的相對分子質(zhì)量將目的蛋白條帶剪切，按照目的蛋白相對分子質(zhì)量計算所需轉(zhuǎn)膜時間（轉(zhuǎn)膜電壓20 V）。轉(zhuǎn)膜畢，進行麗春紅染色以評估電泳和轉(zhuǎn)膜效果。隨后，將PVDF膜封閉于含5%BSA的Tris鹽溶液中1 h，與特定蛋白一抗的TBST溶液（含5%BSA）混合孵育4℃過夜，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及β-tubulin。用TBST溶液洗滌3次后，將PVDF膜與1∶3000的HRP-conjugated二抗在室溫下孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)直接對目標(biāo)蛋白水平進行檢測分析。用QuantityOne對蛋白的Western印跡結(jié)果進行半定量分析，檢測蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中所有實驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示。用Windows版本的SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析比較。對照組和藥物組細(xì)胞的各參數(shù)指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)差異均采用t檢驗進行分析，以P＜0.05作為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞體外增殖速率的影響

通過MTT檢測評估淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞體外增殖速率的影響，結(jié)果如圖1。加入淫羊藿苷的第3 d，實驗組細(xì)胞的增殖速率較對照組提高了 36.8%（P＜0.05）；第5 d，實驗組細(xì)胞的增殖速率同樣顯著高于對照組（P＜0.05），相比對照組提高了33.3%。結(jié)果提示淫羊藿苷干預(yù)能夠顯著提高體外人牙周膜細(xì)胞的增殖速率。

圖1 MTT檢測淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞體外增殖速率的影響

2.2 淫羊藿苷對體外人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

用堿性磷酸酶試劑盒檢測評估淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞體外分化速率的影響，結(jié)果如圖2。在淫羊藿苷干預(yù)的第3 d，實驗組的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），較對照組增加了45.2%；第5 d，實驗組的堿性磷酸酶活性同樣顯著高于對照組（P＜0.05），較對照組增加了33.7%。結(jié)果提示，淫羊藿苷干預(yù)能夠顯著促進人牙周膜細(xì)胞的體外成骨分化潛能。

圖2 堿性磷酸酶檢測試劑盒評估淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞體外成骨分化速率的影響

2.3 淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響

圖3 Real-time PCR檢測淫羊藿苷對體外人牙周膜細(xì)胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響

通過real-time PCR檢測評估淫羊藿苷對體外人牙周膜細(xì)胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表達的影響，結(jié)果如圖3。加入淫羊藿苷的實驗組中人牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)的OCN、Runx2、BMP2基因表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），表達水平分別增加了250.4%、321.6%、552.3%；同時，實驗組中人牙周膜細(xì)胞的破骨相關(guān)RANKL基因表達顯著低于對照組（P＜0.05），相比對照組降低了75.3%。結(jié)果揭示，淫羊藿苷干預(yù)能夠顯著上調(diào)人牙周膜細(xì)胞的體外成骨相關(guān)因子OCN、Runx2、BMP2的基因表達，并顯著下調(diào)破骨相關(guān)因子RANKL的基因表達。

2.4 淫羊藿苷對人牙周膜細(xì)胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響

通過Western印跡檢測評估淫羊藿苷對體外人牙周膜細(xì)胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響，結(jié)果如圖4。在淫羊藿苷作用下，人牙周膜細(xì)胞中的成骨相關(guān)因子（OCN、Runx2和BMP2）的蛋白表達水平相比對照組分別增加了110.3%、191.4%、262.0%，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；實驗組人牙周膜細(xì)胞破骨相關(guān)RANKL蛋白表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），相比對照組降低了47.1%。以上結(jié)果表明淫羊藿苷能夠顯著增加人牙周膜細(xì)胞的體外成骨相關(guān)因子OCN、Runx2、BMP2的蛋白表達，并抑制破骨相關(guān)因子RANKL的蛋白表達。

圖4 Western印跡檢測淫羊藿苷對體外人牙周膜細(xì)胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表達的影響

3 討論

我國中醫(yī)藥資源豐富，歷史悠久，且中藥具有毒副作用小、取材廣泛、藥效明顯的特點。小檗科草本植物淫羊藿是傳統(tǒng)的補腎中藥。《本草綱目》記載，淫羊藿具有“益精氣、堅筋骨、實腰膝、強心力”之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿屬植物的化學(xué)成分主要為黃酮、木脂素、生物堿和多糖，此外還有揮發(fā)油、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等。黃酮類化合物為淫羊藿的主要有效成分，而淫羊藿苷是淫羊藿的主要黃酮類成分，是淫羊藿及其制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。淫羊藿苷具有免疫調(diào)節(jié)、補腎壯陽、抗腫瘤、抗菌消炎多種生物藥理作用[8-9]。

十余年來，淫羊藿苷對于骨代謝和骨質(zhì)疏松的作用效果得到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠顯著抑制骨質(zhì)疏松動物的骨丟失進程，并顯著改善骨質(zhì)疏松動物的骨質(zhì)量[10]。而淫羊藿苷對于加速骨損傷修復(fù)和骨不連的延遲愈合的積極效應(yīng)也有一些文獻報道[11-12]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以顯著促進體外骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨性分化和成骨細(xì)胞的分化成熟[13-14]。同時，也發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠促進成骨細(xì)胞的增殖、成熟、成骨分化和新骨礦化基質(zhì)形成能力[15]。并且，淫羊藿苷也被證實能夠顯著抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收活性[16]。但是，淫羊藿苷對于牙周膜細(xì)胞活性和分化潛能的調(diào)控作用及機制目前尚未被系統(tǒng)闡明。

牙周膜細(xì)胞作為牙周組織中最多且最重要的細(xì)胞群，在牙周組織的損傷修復(fù)與再生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。尤其對于牙周炎患者，牙周膜組織的結(jié)構(gòu)退化和牙周膜細(xì)胞的活性功能損傷是誘發(fā)其牙齒功能損傷的重要因素。而牙周膜細(xì)胞群也被認(rèn)為是牙周組織工程研究的最重要種子細(xì)胞類型之一。本研究的MTT結(jié)果揭示，我們的原代細(xì)胞經(jīng)過淫羊藿苷干預(yù)后表現(xiàn)出更高的增殖速率。淫羊藿苷顯著增加了人牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量，而細(xì)胞群數(shù)量的增加不僅在一定程度上反映了細(xì)胞活性的促進效應(yīng)，并且對于牙周膜細(xì)胞趨向成骨細(xì)胞的定向分化的促進具有積極效應(yīng)。堿性磷酸酶是由骨質(zhì)中成骨細(xì)胞分泌的，反映骨質(zhì)中鈣鹽水平和機體鈣吸收能力的酶類，其活性反映成骨細(xì)胞的活性和功能狀況，并能夠代表成骨分化的趨勢[17]。我們的研究揭示3、5 d的淫羊藿苷干預(yù)均能顯著提高牙周膜細(xì)胞的堿性磷酸酶表達水平。表明淫羊藿苷能夠顯著促進牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞的定向分化潛能，并提升其中成骨細(xì)胞的細(xì)胞活性和功能狀況。

OCN主要由成骨細(xì)胞合成并分泌，在機體骨鈣代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠反映成骨細(xì)胞的成熟、分化和成骨能力[18]。Runx2作為骨組織中最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在成骨細(xì)胞產(chǎn)生和成熟中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[19]。BMP2是一種具有強誘導(dǎo)成骨分化能力的信號分子，也被認(rèn)為是成骨細(xì)胞活性和功能的重要標(biāo)志物[20]。我們的realtime PCR和Western印跡結(jié)果均揭示，淫羊藿苷干預(yù)后牙周膜細(xì)胞的OCN、Runx2和BMP2基因和蛋白表達水平均顯著性增加。這進一步證明淫羊藿苷能夠顯著促進牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞的定向分化能力，并促進成骨細(xì)胞的成熟和新骨形成功能。

RANKL是一種促進破骨細(xì)胞形成和成熟的調(diào)控因子，主要與破骨細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合啟動破骨細(xì)胞胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。RANKL是反映骨組織中破骨細(xì)胞活性和骨吸收功能的細(xì)胞因子[21]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷作用后，體外牙周膜細(xì)胞中的RANKL表達水平顯著降低。這一結(jié)果提示淫羊藿苷作用后牙周膜細(xì)胞中的噬骨（骨吸收）能力被顯著減弱，進一步證實了淫羊藿苷對于骨合成和分解代謝的雙向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究表明淫羊藿苷能夠顯著促進體外人牙周膜細(xì)胞的增殖和定向成骨分化潛能，并能夠上調(diào)成骨相關(guān)的OCN、Runx2和BMP2的基因和蛋白表達，顯著抑制破骨相關(guān)的RANKL的基因和蛋白表達。本研究不僅可為牙周炎的藥物治療提供實驗依據(jù)，也能為基于組織工程技術(shù)的牙槽骨和牙周組織的損傷修復(fù)再生提供新思路。