霍雨薇，丁雨，朱國念，吳思思

四川大學華西醫(yī)院 a.精準醫(yī)學研究中心，b.公共實驗技術(shù)中心，四川 成都 610041

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是泌尿外科最常見的疾病之一，由于BPH的高發(fā)病率及對生活質(zhì)量的嚴重影響，尤其是老年男性患者[1-2]，因此對BPH的治療一直是臨床研究的重點之一。研究顯示，前列腺增生是上皮和基質(zhì)成分混合增生的疾病。前列腺腺體可以分為上皮和基質(zhì)兩部分，這兩個部分在正常前列腺體積中所占比例約為1∶2，隨著年齡的增加，前列腺的基質(zhì)細胞逐漸增多，而上皮細胞逐漸減少。所以基質(zhì)增生為最主要的病理特征，在BPH的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[3-5]。BPH發(fā)病過程緩慢，而構(gòu)建動物模型耗時、耗力。前列腺原代基質(zhì)細胞（primary stromal cell，PSC）離體時間短，遺傳性狀和體內(nèi)細胞相似，適于做細胞形態(tài)、功能和分化等研究[6]，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，所以培養(yǎng)前列腺PSC不但可以模擬BPH體內(nèi)環(huán)境，而且成本較低，因而成為目前BPH基礎(chǔ)研究的重要模型[7]。前列腺PSC原代培養(yǎng)成功率低，生存時間短，傳代次數(shù)少，其中分離提取的前列腺PSC貼壁性差、增殖率低是最大瓶頸。且因為樣本來源于臨床老年患者，手術(shù)方式多為經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)，導致細胞活性低，爬出量極少。為此，我們在借鑒國內(nèi)外學者研究方法的基礎(chǔ)上，對3種不同的前列腺PSC培養(yǎng)方法進行了探索研究，最后確立一種胰酶消化組織塊貼壁培養(yǎng)前列腺PSC的方法，為獲取PSC提供更為簡便的途徑。

1 材料與方法

1.1 標本來源

四川大學華西醫(yī)院泌尿外科2016-12～2017-08因良性前列腺增生經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)手術(shù)標本，供者年齡均大于70歲。所有前列腺標本均經(jīng)病理檢查診斷為良性前列腺增生，排除前列腺癌、膀胱移行細胞癌前列腺組織浸潤等病變。

1.2 材料

澳洲特級胎牛血清（CLARK Bioscience公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、胰蛋白酶（Hyclone公司）；平滑肌α肌動蛋白抗體（Abcam公司）；波形蛋白抗體（武漢艾美捷科技有限公司）。

1.3 取材及預處理

手術(shù)室無菌條件下切取新鮮良性前列腺增生組織標本，置于無血清培養(yǎng)基中，冰上快速運至實驗室。提前配制含青霉素（200 IU/mL）、鏈霉素（200 μg/mL）的雙抗PBS緩沖液（僅用于組織預處理），在超凈工作臺中用眼科剪小心剪去電切燒焦、毛細血管等部分，用PBS緩沖液沖洗3次。

1.4 組織塊法

取高溫滅菌后的安瓿瓶，將預處理后的組織放入安瓿瓶中，剪切至1 mm3大小，分別將組織塊以間距5 mm左右均勻鋪于培養(yǎng)皿（預先用含雙抗的培養(yǎng)基潤洗底部）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后加入1 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含20%特級胎牛血清、雙抗溶液），24 h后補加完全培養(yǎng)基至正常量。

1.5 膠原酶消化法

配置消化液［12 mgⅠ型膠原酶（1 mg/mL），0.6 mg DNA酶（0.1 mg/mL）］、終止液［無血清培養(yǎng)基DMEM，EDTA（2 mmol/L）］。組織樣本經(jīng)預處理后，剪切至1 mm3大小，加入3倍組織體積的消化液，37℃振蕩消化10 min，800～1000 r/min離心去上清液，在組織塊中加入新消化液，37℃振蕩消化30～40 min，加入終止液終止消化，離心收集上清液，400 r/min離心，棄上清收集細胞，加入完全培養(yǎng)基（DMEM高糖+20%胎牛血清+雙抗）重懸，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 胰酶消化組織塊貼壁法

組織樣本經(jīng)預處理后，剪切至1 mm3大小,加入3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶，于37℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩消化10 min，瞬時離心棄上清后，再加3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶，再次消化10～20 min，消化至組織塊一經(jīng)搖動即成細胞團塊則認為消化充分。800 r/min離心3 min去除上清中的膠質(zhì)團塊并棄上清，加少量培養(yǎng)基重懸，以間距5 mm左右將組織塊接種至培養(yǎng)皿（接種可用槍尖或鑷子輕鋪，培養(yǎng)皿預先用血清浸潤處理），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，沿培養(yǎng)皿壁緩慢加1 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后補加完全培養(yǎng)基至正常量。

1.7 細胞傳代

培養(yǎng)至第2周，胰酶消化組織塊貼壁法中組織塊周圍細胞游出及增殖量已達到培養(yǎng)皿的80%左右，進行第1次原代細胞傳代。吸去培養(yǎng)基，用含雙抗的PBS清洗2次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶于37℃消化，顯微鏡下觀察，當呈現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心3 min，吸去上清，加入新的完全培養(yǎng)基重懸，按1∶3接種至新培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 細胞凍存與復蘇

1.8.1 細胞凍存液配制 DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%DMSO（9∶1），4℃預冷備用。

1.8.2 細胞的凍存 待胰酶消化組織塊貼壁法中傳代培養(yǎng)的細胞生長到對數(shù)期時進行凍存，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察，當呈現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大時，加入等體積培養(yǎng)基終止消化，收集至離心管中并計數(shù)。1000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入凍存培養(yǎng)液重懸，細胞最終密度為5×106～10×106/mL。輕輕混勻后加入1 mL懸液于無菌凍存管，將凍存管放入程序降溫盒中，-80℃凍存過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮凍存。

1.8.3 細胞的復蘇 從液氮中快速取出凍存管，在37℃水浴鍋內(nèi)盡快融化，吸出細胞懸液至離心管，加入5倍以上體積的培養(yǎng)液，混勻后800 r/min離心3 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。細胞生長至3 d后進行傳代。

1.9 前列腺PSC免疫熒光鑒定

對胰酶消化組織塊貼壁法培養(yǎng)的第2代細胞進行免疫熒光鑒定。取3.0×104細胞接種至24孔板中，制備細胞爬片；PBS浸洗爬片3次；加4%多聚甲醛固定爬片30 min，PBS浸洗爬片3次，4 min/次；加 0.2%Triton X-100室溫通透 3 min，PBS浸洗爬片3次，3 min/次；3%牛血清白蛋白室溫封閉 30 min，PBS浸洗爬片 3次，3 min/次；加400 μL小鼠抗波形蛋白抗體（1∶500）及兔抗平滑肌α肌動蛋白抗體，4℃過夜，PBS洗3次，3 min/次；加400 μL FITC標記山羊抗小鼠IgG，室溫1 h，避光，PBS 洗 3次，3 min/次；DAPI（1∶1000）染細胞核1 min，PBS洗4次；防熒光淬滅劑封片，熒光正置顯微鏡成像。

1.10 前列腺PSC增殖曲線測定

取第3代細胞，以約1.0×104/孔接種于24孔板，每天取3孔細胞，棄掉培養(yǎng)基，加0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，用血球計數(shù)板計數(shù)貼壁細胞，取3孔細胞計數(shù)的平均值作為該時間組的細胞數(shù)目。連續(xù)計數(shù)7 d，記錄并繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 不同原代培養(yǎng)方法的比較

圖1A為膠原酶消化法的原代細胞，貼壁細胞少，狀態(tài)差；圖1B是采用組織塊貼壁法培養(yǎng)14 d后得到的細胞，細胞游出速度較慢，細胞量少且未展開貼壁；圖1C、D為采用胰酶消化組織塊貼壁法培養(yǎng)7 d后的細胞量，細胞透明度高，折光性強，形態(tài)均一，呈長梭形。

10 d細胞生長至瓶底的70%～80%，進行1∶2傳代，3 d左右細胞即可融合成片。細胞多呈長梭形，融合后呈纖維狀排列（圖2A）。細胞狀態(tài)好，予以凍存，復蘇后細胞存活率約為80%（圖2B）。本實驗傳到第3代，細胞狀態(tài)較好。

圖1 不同方法培養(yǎng)人前列腺PSC顯微圖像

圖2 細胞傳代及復蘇顯微圖像

2.2 原代前列腺PSC純度鑒定

選取第3代前列腺PSC進行免疫熒光鑒定，平滑肌α肌動蛋白與波形蛋白染色均為陽性（圖3），顯微鏡下隨機選擇5個不同區(qū)域計數(shù)陽性細胞與細胞總數(shù)之比，結(jié)果顯示，獲取的第3代前列腺PSC純度為95.3%±2.4%。

圖3 前列腺PSC免疫熒光鑒定

2.3 前列腺PSC增殖活力測定

由于胰酶消化組織塊法的原代細胞與第2代培養(yǎng)的前列腺PSC內(nèi)混雜有少量上皮細胞，因此僅對純化后的第3代PSC進行生長曲線分析[8-9]。血球板計數(shù)法連續(xù)7 d計數(shù)PSC的增殖能力，結(jié)果見圖4。生長前2 d細胞增殖較少，提示PSC在此時間段增殖能力較弱；2～4 d增殖變化比前2 d顯著（P＜0.05），提示此段時間內(nèi)細胞出現(xiàn)增殖，處于對數(shù)生長期；5～7 d增殖停滯，與理性的實驗細胞生長曲線一致。

圖4 前列腺PSC生長曲線

3 討論

良性前列腺增生以中老年男性為高發(fā)群體，是引起排尿障礙的最常見病因。BPH可導致患者尿道延長、受壓變形以及尿道阻力增加，使得膀胱內(nèi)壓升高，繼而引起排尿期、儲尿期相關(guān)癥狀，甚至造成上尿路功能及結(jié)構(gòu)損害，臨床出現(xiàn)下尿路梗阻癥狀，雖然其屬于良性病變，但嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。原代培養(yǎng)的細胞生物學特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，能最接近和反映體內(nèi)生長特性[11-12]。為了解BPH疾病的發(fā)病機理，建立一種高效可行的人前列腺基質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)方法尤為重要。

臨床來源的組織，因其組織位置、離體后儲存、長距離運輸，極易被微生物污染，且術(shù)中采用的電切術(shù)可致組織表面部分呈焦狀，增加了污染風險，加大了實驗難度，因此需要快速取出且放入無菌緩沖液中運至實驗室進行原代分離培養(yǎng)。本實驗所用組織來源于經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的患者，大部分組織表面呈焦狀，此部分細胞已無法進行分離培養(yǎng)，需用眼科剪將焦狀部分祛除，再用含雙抗的PBS清洗3～4次，然后進行組織塊的剪切和消化操作，最后加入完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。經(jīng)多批次、長時間摸索，既規(guī)避了因污染導致原代培養(yǎng)失敗的可能性，使細胞生長狀況得到改善，同時也使細胞數(shù)目增多、生長周期縮短。

據(jù)有關(guān)資料顯示，多數(shù)國家統(tǒng)計表明組織學上增生發(fā)生率與年齡成正相關(guān)，其發(fā)生幾率幾乎是50歲以上50%、60歲以上60%、70歲以上70%、80歲以上80%～100%[13]。實驗中的臨床組織來源患者均大于70歲，由于年齡較大，使得組織活性較低，細胞爬出速度慢，細胞量極少，很難獲得非惡性和高度分化的基質(zhì)細胞株[14]。本研究結(jié)果表明，預處理后的組織先進行胰酶消化，能使組織內(nèi)部細胞變得松散，便于細胞游離出，縮短培養(yǎng)周期；胰酶消化后將組織塊貼壁培養(yǎng)，貼壁較牢，不易脫落且易于細胞游離出，采用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可使細胞游出更快、得率更高。

通過設計系列對照實驗，采用胰酶消化組織塊貼壁法、完全培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)了人前列腺基質(zhì)細胞，所得細胞生長狀態(tài)良好，且能夠進行傳代，為后續(xù)研究提供了簡單易行的方法。