張桂枝，劉 璐，靳雙星*，王衛(wèi)民

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046；3.河南智龍生物科技有限公司，河南新鄉(xiāng) 453731）

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等多種真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[1]。在十多種次級代謝產(chǎn)物中，黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種分布最廣、毒性高和誘變致癌性強(qiáng)的真菌次級代謝產(chǎn)物，其毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[2]。若動物采食一段時間被黃曲霉毒素污染的飼料后，會引起采食量下降、生產(chǎn)性能降低，后期還會導(dǎo)致黃疸、肝臟腫大、免疫抑制和癌變等[3]。殘留在動物體內(nèi)的AFB1可通過食物鏈威脅人類健康。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）2002 年調(diào)查顯示，目前世界上每年受到霉菌毒素不同程度污染的谷物量至少達(dá)25%，黃曲霉毒素的危害最為嚴(yán)重[4]。有研究證明，玉米、麩皮、餅粕類和酒糟蛋白飼料（DDGS）中AFB1的檢出率分別高達(dá)50%、46%、36%和94%[5]。因此，控制和降解霉菌毒素的污染迫在眉睫。

據(jù)報道，枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑具有耐酸、耐鹽、耐高溫、易儲存加工和運(yùn)輸?shù)忍匦訹6]，在飼料制粒、貯存及胃酸環(huán)境中仍能保持高活性；能自身合成蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，可有效降解復(fù)雜的碳水化合物和黃曲霉毒素[7-11]，還能刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，激活淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體含量，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能[12-15]；還能改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)動物生長和提高抗病力[16-18]。本試驗(yàn)旨在研究添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對飼喂含AFB1飼糧的肉雞免疫功能的影響，驗(yàn)證枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑在體內(nèi)試驗(yàn)中的有效性，為減輕AFB1的危害及該制劑在生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 枯草芽孢桿菌體外對AFB1的降解作用 將枯草芽孢桿菌（由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供）接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)72 h，取其發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，然后取上清液0.8 mL 加入0.2 mL100 μg/kg AFB1標(biāo)品（Sigma 公司）；空白對照為0.8 mL LB 液體培養(yǎng)基加入0.2 mL100 μg /kg AFB1標(biāo)品，靜置反應(yīng)3 d。采用ROMER 國際貿(mào)易（北京）有限公司提供的AFB1檢測試劑盒測定AFB1含量，并計算AFB1降解率。

AFB1降解率=（空白對照AFB1含量－試驗(yàn)組AFB1含量）/空白對照AFB1含量×100%

1.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑生產(chǎn)工藝 將枯草芽孢桿菌接種到LB 液體培養(yǎng)基（北京華越洋生物公司）中，在37℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)16～18 h 后，調(diào)整活菌數(shù)達(dá)1×109CFU/mL；取發(fā)酵液按4%接種量與經(jīng)滅菌的含有麩皮、葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂等固體培養(yǎng)基混勻接種，隨后在37℃條件下發(fā)酵72 h，低溫干燥制成，有效活菌數(shù)≥1×108CFU/g，由河南智龍生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計及飼養(yǎng)管理 200 只1 日齡AA 肉仔雞（購于開封大富種禽有限公司）觀察飼養(yǎng)至5 日齡時，選取180 只稱重并隨機(jī)分為3 組，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)12 只，性別比例一致。A 組飼喂基礎(chǔ)飼糧（開封正大公司）；B 組在基礎(chǔ)飼糧中添加100 μg/kg AFB1；C 組在B 組基礎(chǔ)上添加0.1%枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑。

試雞采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，前3 d 每天24 h 光照，溫度控制在32～35℃，濕度65%～70%，之后溫度、濕度適當(dāng)降低。雞自由采食、飲水，3 組雞均在7 日齡1.5倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫疫苗，14 日齡1.5 倍量滴口接種法氏囊疫苗（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司），21日齡3 倍量飲水免疫新城疫疫苗。按雞場管理程序進(jìn)行飼養(yǎng)管理，飼養(yǎng)周期為42 d。

1.4 新城疫（ND）血清抗體滴度的測定 采用HA-HI試驗(yàn)。分別于14、21、28、35 日齡，每組取10 只，每個重復(fù)隨機(jī)取2 只翅靜脈采血，自然狀態(tài)析出血清，按《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550-2008）檢測A、B、C 組雞血清中的ND-HI 效價，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 法氏囊（IBD）血清抗體滴度的測定 于21、28、35 日齡，每組取10 只，每個重復(fù)隨機(jī)取2 只，翅靜脈采血，自然狀態(tài)析出血清，采用間接ELISA 方法（ELISA酶標(biāo)儀為Thermo 公司生產(chǎn)）檢測血清中IBD 抗體（檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司），并計算各組抗體效價的平均值。

log10 抗體效價=1.1×log[（待檢樣品的平均OD值－陰性對照的平均OD 值）/（陽性對照的平均OD 值－陰性對照的平均OD 值）]+3.361

抗體效價=逆對數(shù)

1.6 血清免疫指標(biāo)和免疫器官指數(shù)的測定 各組飼喂至42 日齡，每組取15 只，每個重復(fù)隨機(jī)取3 只，采集血液，3 000 r/min 離心10 min 分離血清。同時摘取脾臟、法氏囊、雙側(cè)胸腺，剝離脂肪和結(jié)締組織，稱其重量并計算免疫器官指數(shù)。血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量的測定按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明進(jìn)行。

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量（g）/體重（kg）1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌體外對AFB1降解效果 將枯草芽孢桿菌在37℃培養(yǎng)72 h，其發(fā)酵液對AFB1的降解率達(dá)到85.33%，證明該菌發(fā)酵液具有較強(qiáng)的降解AFB1的能力。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞ND-HI 效價的影響 由表1 可知， B 組14 日齡雞血清中ND-HI 效價低于A 組和C 組（P＞0.05）；B 組21、28、35 日齡雞ND-HI 效價與A 組相比分別顯著降低了0.4log2、1.0log2和 1.2log2（P＜0.05），說明AFB1能顯著降低AA 肉仔雞ND 疫苗免疫效果。C 組21、28、35 日齡雞ND-HI效價較B 組分別顯著提高了0.6log2、1.1log2 和1.3log2（P＜0.05），A、C 組間無顯著差異，說明枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能顯著改善AFB1對ND 疫苗免疫的影響，使ND 疫苗免疫效果恢復(fù)到正常水平。

表1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞ND-HI 效價的影響

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞IBD 抗體效價的影響 由表2 可知，B 組21、28、35 日齡雞血清中IBD 抗體值較A 組分別降低30.24%、39.95%和42.22%（P＜0.05），說明AFB1能顯著降低AA 肉仔雞IBD 疫苗免疫效果。C 組21、28、35 日齡雞血清中IBD 抗體值較B 組分別提高了37.16%、63.82%和79.50%（P＜0.05）；3 個日齡A、C 組間雞血清中IBD抗體均無顯著差異，說明枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能顯著改善AFB1對IBD 疫苗免疫的影響，使IBD 疫苗免疫效果恢復(fù)到正常水平。

表2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞IBD 抗體效價的影響

2.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞免疫器官指數(shù)的影響 由表3 可知，B 組雞脾臟指數(shù)略高于A、C 組（P＞0.05）。B 組胸腺和法氏囊指數(shù)較A 組分別降低25.65%和 21.43%（P＜0.05），說明AFB1中毒能抑制AA 肉仔雞胸腺和法氏囊的發(fā)育，導(dǎo)致胸腺、法氏囊指數(shù)降低。C 組胸腺和法氏囊指數(shù)較B 組分別提高了38.73%和 24.24%（P＜0.05），A、C 組間無顯著差異，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能夠改善AFB1對胸腺和法氏囊發(fā)育抑制作用的影響，使AA 肉仔雞胸腺和法氏囊發(fā)育恢復(fù)到正常水平。

表3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞血清中免疫球蛋白的影響 由表4 可知，B 組雞血清中IgA、IgG 和IgM 水平較A 組分別降低16.72%、56.61%和30.44%（P＜0.05），說明AFB1中毒能顯著降低AA 肉仔雞血清中IgA、IgG 和IgM 含量。C 組雞血清中IgA、IgG和IgM 水平較B 組分別提高了57.16%、139.08%和114.86%（P＜0.05），A、C 組間無顯著差異，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能顯著提高飼喂AFB1肉仔雞血清中IgA、IgG 和IgM 水平，減少AFB1對其抑制作用的影響，使其恢復(fù)到正常水平。

表4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AA 肉雞血清中免疫球蛋白的影響 μg/mL

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌體外對AFB1的降解作用 本試驗(yàn)選用的枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵上清液對AFB1的降解率為85.33%；雷元培等[19]從動物腸道中分離得到的枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵上清液對AFB1的降解率為 81%；張盼等[11]從納豆中篩選到的枯草芽孢桿菌Natto3 具有較強(qiáng)的降解AFB1的能力，降解率受培養(yǎng)時間、溫度、pH、金屬離子等影響。Farzaneh 等[20]從伊朗開心果中分離得到枯草芽孢桿菌UTBSP1，對開心果樣品中AFB1的降解率達(dá)到 95%。孫玲玉[7]從泰山腳下土壤中分離出具有降解 AFB1作用的枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵上清液對AFB1的降解率達(dá) 90.28%?？莶菅挎邨U菌對AFB1的降解可能是由于其代謝過程中所產(chǎn)生的酶作用，其作用機(jī)制還有待研究。

3.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AFB1中毒AA 肉仔雞血清中ND 和IBD 抗體效價的影響 黃曲霉毒素能影響動物免疫系統(tǒng)，引起B(yǎng) 淋巴細(xì)胞活性降低、抗原遞呈細(xì)胞和吞噬細(xì)胞功能受到影響，干擾免疫接種與體內(nèi)獲得性免疫，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。呂武興等[21]研究表明，日糧中AFB1含量為50 μg/kg 和75 μg/kg 時可影響肉鴨禽流感抗體合格率，降低禽流感疫苗的有效性。本試驗(yàn)中，飼糧中添加100 μg/kg AFB1能顯著降低AA肉仔雞ND 和IBD 疫苗的免疫效果；添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能明顯改善AFB1中毒導(dǎo)致ND 和IBD 抗體效價下降的狀況，使ND 和IBD 疫苗免疫效果恢復(fù)到正常水平。

3.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AFB1中毒AA 肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響 黃曲霉毒素能夠誘導(dǎo)免疫器官的腫脹、萎縮或壞死，進(jìn)而抑制家禽的免疫功能[22]。侯然然等[23]研究表明，肉仔雞日糧中添加0.1 mg/kg AFB1會導(dǎo)致脾臟腫脹、胸腺和法氏囊萎縮。于正強(qiáng)[24]研究表明，AFB1可通過活化線粒體和死亡受體途徑引起胸腺細(xì)胞過度凋亡，通過活化線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑引起雛雞法氏囊細(xì)胞過度凋亡。本試驗(yàn)中，飼糧中添加100 μg /kg AFB1能顯著降低AA 肉仔雞胸腺和法氏囊的發(fā)育，添加草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能夠改善AFB1對胸腺、法氏囊發(fā)育的抑制作用，使其恢復(fù)到正常水平?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵制劑能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，究其原因，首先是免疫器官的生長發(fā)育和成熟有賴于抗原的刺激；芽孢桿菌作為非特異性免疫因子，通過細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分刺激機(jī)體免疫細(xì)胞，使其激活，產(chǎn)生促分裂因子，促進(jìn)細(xì)胞活力或作為佐劑發(fā)揮作用；另外，芽孢桿菌在腸道內(nèi)可合成維生素、氨基酸等多種有益物質(zhì)，直接促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育[25]。

3.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑對AFB1中毒AA 肉雞血清中免疫球蛋白的影響 黃曲霉毒素通過不同機(jī)制抑制動物和人體DNA、RNA 和蛋白合成[26]。Turner 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，接觸了黃曲霉毒素的兒童唾液中免疫球蛋白A（slgA）水平明顯下降。本試驗(yàn)中，飼糧中添加100 μg/kg AFB1能顯著降低AA 肉仔雞血清中IgA、IgG 和IgM 含量?？莶菅挎邨U菌具有免疫增強(qiáng)作用，能夠提高免疫球蛋白和抗體含量。孫煥林[28]報道飼料中添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕能顯著提高肉雞血清中IgA 和IgM 含量。李衛(wèi)芬等[29]研究報道，肉雞日糧中添加適量的枯草芽孢桿菌制劑可以顯著提高IgA 的分泌。余東游等[25]報道，日糧中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞血清中IgG 水平。本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能明顯改善AA 肉仔雞因AFB1中毒引起的血清IgA、IgG 和IgM 含量降低現(xiàn)象，減少AFB1對機(jī)體的免疫抑制作用，使IgA、IgG 和IgM 水平恢復(fù)正常。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼糧中添加AFB1可導(dǎo)致AA肉仔雞ND 和IBD 疫苗的有效性降低、胸腺和法氏囊的指數(shù)降低及血清中IgA、IgG、IgM 含量降低。添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑能明顯改善AA 肉仔雞AFB1中毒對ND 和IBD 疫苗免疫效果、免疫器官發(fā)育及免疫球蛋白含量的影響，使其恢復(fù)至正常水平。