付敬敬, 王 磊,張 凱,張 康,張景艷,王旭榮, 崔東安, 王學兵, 李建喜，薛 洋，陳澤文

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所,蘭州 730050；2.甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050；3.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,鄭州 450002)

病原性大腸桿菌所引起的局部或全身感染性疾病，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的危害，造成巨大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌生物膜的形成導致致病力和耐藥性升高，根據(jù)疾病預防控制中心(CDC)統(tǒng)計，人類約65%的細菌感染性疾病與致病菌生物膜形成有關[1-2]。細菌生物膜(Biofilm，BF)是細菌黏附在非生物或生物表面，并被自身分泌的胞外多聚物包裹形成的一種高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜狀結構；是細菌在惡劣環(huán)境中為適應生存環(huán)境而形成的一種與浮游狀態(tài)相對應的存在形式。生物膜內(nèi)有細胞外基質(zhì)包裹的多層細菌生長，可避免被宿主防御系統(tǒng)清除，并阻礙大部分抗菌藥物進入細菌內(nèi)[3]。與浮游細胞相比，形成生物膜的細菌對抗菌藥物作用的抵抗力會提高 10～1 000倍[4]。形成生物膜的細菌具有高度耐藥性和能逃避免疫系統(tǒng)攻擊的特點，使其感染易慢性化并難于控制[5]。本研究利用響應面法優(yōu)化大腸桿菌生物膜(Escherichiacolibiofilm)的培養(yǎng)條件，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察形成的生物膜，為進一步開展抑制大腸桿菌生物膜形成的藥物研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 ATCC25922標準菌株購自美國微生物菌株保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、LB肉湯、LB瓊脂，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器及試劑 PBS緩沖液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；結晶紫(生物染色極，MACKLIN公司)；96孔板(Coster公司)；超純水儀、生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技集團)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈兒儀器制造有限公司)；酶標儀Spectra Max M2(美國 Molecular Devices公司)；ZEISS激光共聚焦顯微鏡LSM 700 SYSTEM；LIVE/DEAD試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；冰乙酸、甲醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌的復蘇培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱取出保存的菌株，吸取適量菌液接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h；將過夜培養(yǎng)的菌液接種至麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h；從麥康凱培養(yǎng)基中挑取紅色單菌落，接種至新配制的培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫100 r/min震蕩培養(yǎng)16～24 h。

1.2.2 大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)-96孔微量板法 參照Ai-Shabib等[6]的方法并略做改動。將培養(yǎng)好的菌液用LB培養(yǎng)基稀釋至一定濃度，以每孔200 μL加入96孔U型板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個樣品做6個平行，以培養(yǎng)基為空白對照。

1.2.3 大腸桿菌生物膜的測定-結晶紫法 將培養(yǎng)好的96孔U型板從恒溫箱中取出，吸棄菌液；每孔250 μL 1×PBS緩沖液輕洗96孔U型板，重復2次，棄洗液，晾干；加甲醇至96孔U型板中，每孔200 μL，固定15 min，倒出并晾干；將0.3 g/mL結晶紫溶液以每孔200 μL加入96孔U型板中，邊加邊晃動，染色5 min，自來水沖洗，拍干；將φ=33%冰乙酸加至96孔U型板中，每孔200 μL，待細菌生物膜完全溶解后，用酶標儀測定OD600nm。

1.2.4 單因素試驗 培養(yǎng)時間對大腸桿菌生物膜形成量的影響：將培養(yǎng)好的細菌用pH 7.5的LB培養(yǎng)基稀釋至1.2×108cfu/mL，以每孔200 μL加入96孔U型板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)4 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h和96 h取出，通過結晶紫法染色測定OD600nm。

pH對大腸桿菌生物膜形成量的影響：將培養(yǎng)好的細菌分別用pH為6.5、7.5和8.5的LB培養(yǎng)基稀釋至1.2×108cfu/mL，每孔200 μL加入96孔U型板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后取出，通過結晶紫法染色測定OD600nm。

細菌濃度對大腸桿菌生物膜形成量的影響：將培養(yǎng)好的細菌用pH 7.5的LB培養(yǎng)基分別稀釋至 1.2×105cfu/mL、1.2×106cfu/mL、1.2×107cfu/mL、1.2×108cfu/mL和1.2×109cfu/mL，以每孔200 μL加入96孔U型板中， 37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后取出，通過結晶紫法染色測定OD600nm。

1.2.5 響應法優(yōu)化試驗設計 根據(jù)中心組合設計原理，結合響應面分析方法，綜合單因素試驗結果，以細菌濃度(A)、pH(B)和時間(C)3個因素為自變量，生物膜形成量(OD600nm)為響應值，設計3因素3水平共17個試驗點(其中12個為析因試驗，5個為中心試驗)的響應面分析試驗[7]，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 響應面因素水平編碼Table 1 Factors and levels code of response surface

1.2.6 大腸桿菌生物膜的驗證培養(yǎng) 按照 “1.2.2”的方法，以優(yōu)化的條件培養(yǎng)大腸桿菌生物膜，待生物膜形成后，采用結晶紫法染色測定OD600nm。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間大腸桿菌形成生物膜的情況 將培養(yǎng)好的細菌用 pH 7.5的LB培養(yǎng)基稀釋至1.2×107cfu/mL，以每孔200 μL加入96孔U型板中，分別于 37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h、12 h和20 h后取出，棄菌液， 1×PBS清洗3次；每孔加入200 μL LIVE/DEAD染料混合物作用15 min，4 ℃ 避光放置，棄染液，1×PBS清洗3次，通過激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜中的細菌活性并拍照。

1.2.8 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)時間對大腸桿菌生物膜形成量的影響 以1.2×108cfu/mL的菌濃度接種，用pH為7.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌生物膜，結晶紫法染色后檢測結果表明(表2)，隨著培養(yǎng)時間增加，細菌生物膜量升高，12 h時達到最高，隨后生物膜量遞減。因此，選取12 h為最佳培養(yǎng)時間。

表2 不同培養(yǎng)時間下大腸桿菌生物膜的形成量Table 2 Biofilm formation amount of E.coli under different culture time

2.1.2 pH對大腸桿菌生物膜形成量的影響 以1.2×108cfu/mL的細菌濃度接種，用不同pH的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，大腸桿菌生物膜的形成量表明(表3)，使用pH 7.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，生物膜形成量最高；pH 6.5和8.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌生物膜形成量顯著降低。因此認為pH 7.5為培養(yǎng)基最佳pH。

表3 不同pH下大腸桿菌生物膜的形成量Table 3 Biofilm formation amount of E.coli under different pH

2.1.3 細菌濃度對大腸桿菌生物膜形成量的影響 使用pH為7.5的培養(yǎng)基，以不同濃度的菌液接種，培養(yǎng)12 h后，細菌生物膜形成量表明(表4)，細菌濃度≥107cfu/mL時，生物膜形成量較高，其中以108cfu/mL組生物膜形成量最高。

表4 不同細菌濃度下大腸桿菌生物膜的形成量Table 4 Biofilm formation amount of E.coli under different bacterial concentration

2.2 響應面分析法優(yōu)選提取工藝

2.2.1 中心組合試驗(Box-Behnken) 根據(jù)Box-Behnken原理設計試驗，結合單因素試驗結果確定因子的水平范圍，進行3因子3水平17個試驗點的試驗，大腸桿菌生物膜形成量(OD600nm)的結果表明(表5)，5個中心試驗點的生物膜形成量較高，12個析因試驗點生物膜形成量較低，OD600nm為0.153 6～0.423 6。

表5 響應面分析試驗Table 5 Response surface analysis experiment

2.2.2 影響大腸桿菌生物膜形成量的主要因素分析 應用Design-Expert軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到細菌濃度(A)、pH(B)和時間(C)與大腸桿菌生物膜OD600nm的二次多項回歸方程：

Y=0.57-0.024A-0.045B-0.011C+ 0.029AB-0.050AC+0.073BC-0.18A2- 0.11B2-0.18C2

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表6。

由表6可知，模型P<0.05，表明模型方程達到顯著水平；失擬項P=0.160 5>0.05，表明差異不顯著，說明本試驗無其他因素的顯著影響，模型是適合的，可用于大腸桿菌生物膜培養(yǎng)條件的優(yōu)化；模型的決定系數(shù)R2=0.965，表明生物膜響應值與各因素實際值及預測值之間具有良好的擬合度。

2.2.3 響應曲面分析 將建立的回歸模型中的兩因素固定在零水平，作響應曲面圖得到另外兩個因素的交互影響結果，手動優(yōu)化后考察交互作用因子對響應值的影響。等高線的形狀可反映交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[8-9]。從響應曲面圖和高線圖可得，細菌濃度與pH的交互作用(圖1)及細菌濃度與培養(yǎng)時間的交互作用(圖2)對細菌生物膜形成量的影響不顯著；pH和培養(yǎng)時間的交互作用對細菌生物膜形成量的影響顯著(圖3)。

表6 大腸桿菌生物膜OD600nm方差分析Table 6 Variance analysis of OD600nm in E.coli biofilm

圖1 細菌濃度及pH對細菌生物膜的響應面及等高線Fig.1 The response surface and contour for bacterial concentration and pH on bacterial biofilm

2.2.4 最佳培養(yǎng)條件的確定 采用SAS 23.0軟件分析得到大腸桿菌生物膜的最優(yōu)培養(yǎng)條件如下：細菌濃度1.2×107cfu/mL、pH 7.5、培養(yǎng)至11.5 h時大腸桿菌生物膜的OD600nm可達最 大值。

2.2.5 優(yōu)化大腸桿菌生物膜培養(yǎng)條件驗證試驗 在優(yōu)化條件下，當細菌濃度為1.2×107cfu/mL，pH為7.5，培養(yǎng)至11.5 h時，經(jīng)結晶紫染色法測定大腸桿菌生物膜OD600nm分別可達 0.581 2和0.588 0。

2.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察 分析不同時間大腸桿菌形成生物膜狀態(tài)的LIVE/DEAD試劑盒中含有SYTO 9和PI 2種熒光染料，已經(jīng)死亡或凋亡的細胞膜受損會被染成紅色，而膜完好的細胞會被染成綠色。培養(yǎng)至4 h、12 h和20 h時，在激光共聚焦顯微鏡下400倍觀察大腸桿菌生物膜的狀態(tài)見圖4。

由圖4可知，400倍下觀察，不同時間形成的大腸桿菌生物膜不同。培養(yǎng)至4 h時，大量細菌黏附在平板上，并且已有細菌聚集體出現(xiàn)，但此時活菌的比例較低；培養(yǎng)至12 h，形成大量的細菌聚集體，80%的視野已經(jīng)被細菌覆蓋，生物膜中的活菌比例較高；培養(yǎng)至20 h時，大量的細菌聚集體依然存在，但此時活菌比例呈現(xiàn)顯著下降趨勢，從CLSM中可明顯觀察到大量的紅色菌體(死菌)。與20 h的生物膜相比，12 h的生物膜量已達高峰，進一步驗證響應面優(yōu)化條件的可行性[10-11]。

圖2 細菌濃度及培養(yǎng)時間對細菌生物膜的響應面和等高線Fig.2 The response surface and contour for bacterial concentration and incubation time on bacterial biofilm

圖3 pH及培養(yǎng)時間對細菌生物膜的響應面和等高線Fig.3 The response surface and contour for pH and incubation time on bacterial biofilm

圖4 培養(yǎng)至4 h(A)、12 h(B)、20 h(C)時大腸桿菌生物膜的激光共聚焦圖(×400)Fig.4 CLSM images of E.coli biofilms cultured at 4 h (A), 12 h (B) and 20 h (C), respectively(×400)

3 討 論

大腸桿菌是最常見的革蘭氏陰性腸道致病菌和條件致病菌[12]，是臨床感染的重要病原菌之一。在特定環(huán)境中大腸桿菌是極易形成生物膜的細菌，一旦形成生物膜，常規(guī)劑量的抗生素和消毒劑均很難起作用，須加大藥物劑量和延長用藥時間，但伴隨而來的是耐藥菌株的產(chǎn)生，致使感染遷延不愈[13-14]。因此，細菌生物膜的形成仍是疾病治療過程中所面臨的一大難題。研究表明：綠膿假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均具有形成生物膜的能力[15]。而生物膜的形成與外界環(huán)境因素變化密切相關，離子環(huán)境、pH、溫度、時間、營養(yǎng)條件等各種環(huán)境因素均會影響細菌生物膜的形成[16-18]。

本試驗選用最常用的LB培養(yǎng)基，通過單因素試驗和響應面分析法優(yōu)化大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時間和細菌接種濃度不同，大腸桿菌生物膜形成量不同，對大腸桿菌生物膜的形成影響能力強弱依次為培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時間和細菌接種濃度。在響應面優(yōu)化試驗中，雖然單因素對細菌生物膜形成的影響無明顯規(guī)律，但二次項均小于0.05。在響應面的三維圖和等高線中能清楚地觀察到單因素之間的兩兩交互作用，其中pH與培養(yǎng)時間的交互作用最顯著，對生物膜的培養(yǎng)影響最大。本研究結果與pH對大腸桿菌生物膜影響的相關研究結果一致[19]。

利用本試驗優(yōu)化的條件培養(yǎng)大腸桿菌生物膜4 h時的狀態(tài)與趙今等[20]、王麗君等[21]通過激光共聚焦顯微鏡觀察的結果相近；但本試驗優(yōu)化的培養(yǎng)時間為11.5 h，較喻華英等[22]大腸桿菌生物膜的培養(yǎng)時間48 h，明顯縮短試驗周期，這可能因培養(yǎng)基的不同引起。運用本研究優(yōu)化的條件培養(yǎng)大腸桿菌生物膜，生物膜形成量(OD600nm)可穩(wěn)定在0.6左右，且細菌活性強，為抑制大腸桿菌生物膜形成藥物的研究奠定基礎[23]。