馮寶珍，李培謙

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000)

灰霉病是由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers. ex Fr.)引起的一類病害，其寄主范圍廣泛，嚴(yán)重危害多種果蔬并造成較大損失。灰霉病的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑，但是由于灰葡萄孢變異快、繁殖迅速，容易產(chǎn)生抗藥性[1]。啶酰菌胺為琥珀酸脫氫酶抑制劑類(Succinate dehydrogenase inhibitor，SDHI)殺菌劑，2004年在英國、德國和瑞士注冊登記，截至2007年，該殺菌劑先后在50個國家注冊登記，用于100種作物80種病害的防治[2]。琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenases, SDHs)廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞及真核生物線粒體內(nèi)膜中，是唯一一種既能參與檸檬酸循環(huán)又負(fù)責(zé)電子傳遞的酶。SDHs蛋白由4個亞基組成，黃素蛋白SdhA和鐵硫蛋白SdhB為親水亞基，SdhC和SdhD則為疏水亞基[3]。啶酰菌胺能夠抑制SDH蛋白活性，直接阻止線粒體呼吸鏈電子傳遞及ATP合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞分裂和生長的能量不足，最終引致真菌死亡[4]。

自灰霉病對奎寧體外抑制劑類殺菌劑產(chǎn)生抗性以來[5]，啶酰菌胺便成為防治該病害的主要?dú)⒕鷦?。由于啶酰菌胺對孢子萌發(fā)及菌絲生長的作用效果明顯，殺菌譜廣泛，對多種病害均具有良好的防治效果，如早疫病、灰霉病、白粉病、核盤菌病害、褐腐病等[5]。但是，單一藥劑的長期使用導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生。研究表明，抗藥性的產(chǎn)生源于病原菌基因發(fā)生點突變，但是各種病原菌點突變的位置和類型各不相同。研究發(fā)現(xiàn)，引起黃瓜褐斑病的多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)對啶酰菌胺的抗性是由于SdhB亞基發(fā)生點突變(H278Y/R)[6]；而鏈格孢(Alternariaspp.)和茄鏈格孢(A.solani)抗性產(chǎn)生的原因則是SdhB(H278Y/R)、SdhC(H132R)及SdhD(H132R)均發(fā)生點突變[7-8]。但是有研究發(fā)現(xiàn)桃褐腐病的病原菌美澳核果褐腐菌(Moniliniafructicola)對啶酰菌胺抗性的產(chǎn)生與基因突變沒有明確的關(guān)系[9]。國外學(xué)者研究表明，灰葡萄孢對啶酰菌胺抗性產(chǎn)生是由于SdhB基因225 (P225F/L/T)和 272 (H272Y/R)位點發(fā)生點突變[10-13]所致。

為明確運(yùn)城地區(qū)番茄灰葡萄孢對啶酰菌胺敏感性現(xiàn)狀及抗藥性類型，利用單孢分離法獲得灰葡萄孢菌株，檢測其對啶酰菌胺的敏感性。分析不同抗性水平菌株的SDH基因，明確其抗藥性機(jī)制，并對不同抗性水平的菌株進(jìn)行適應(yīng)性評價，為灰葡萄孢抗藥性研究及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 供試105個番茄灰葡萄孢菌株于2014-2017年采集于山西運(yùn)城地區(qū)番茄種植保護(hù)地。采用單孢分離法獲得菌株純培養(yǎng)，菌株分離培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 ～ 7 d，然后置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 試驗所用啶酰菌胺(Boscalid)水分散粒劑(96%)由上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備 將啶酰菌胺原藥用丙酮溶液溶解，再加入少量乳化劑(吐溫80)，使其溶解更充分，制備質(zhì)量濃度為32 g/L的啶酰菌胺母液，具體方法參照文獻(xiàn)[14]。在無菌操作臺上，將7.8 μL的啶酰菌胺藥液加入含有50 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，充分混勻后，倒入培養(yǎng)皿中制備含5 μg/mL的啶酰菌胺培養(yǎng)基平板。同樣的方法制備含藥平板，使培養(yǎng)基中啶酰菌胺的終質(zhì)量濃度分別為0(CK)、5、10、20、30 μg/mL。

1.2.2 抗藥性水平測定 利用抑制分生孢子萌發(fā)法以及菌絲生長速率法測定所有供試番茄灰葡萄孢菌株對啶酰菌胺的敏感性，具體方法參照文獻(xiàn)[14]。將直徑5 mm的菌餅接種于上述培養(yǎng)基內(nèi)，然后置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d左右，利用十字交叉法分別測量每個培養(yǎng)皿中的菌落直徑，然后計算其平均值。再利用DPS軟件計算各菌株的菌絲生長抑制率及EC50值。啶酰菌胺抗性水平標(biāo)準(zhǔn)參照Zhang等[15]的報道，以啶酰菌胺對灰葡萄孢菌群體的敏感性基線 EC50= 1.07 μg/mL 作為參照標(biāo)準(zhǔn)。菌株抗性水平計算依據(jù)趙建江等[16]報道的番茄灰葡萄孢菌對啶酰菌胺敏感性測定抗性水平的劃分方法：R<10為敏感 (S)；10 ≤ R< 50為低抗 (LR)；50≤R<100為中抗 (MR)；R ≥100為高抗 (HR)。

1.3 抗性的分子機(jī)制分析

1.3.1 DNA提取 選擇不同抗性水平的菌株各10個，在PDA液體培養(yǎng)基中置于22 ℃搖培3 d，收集菌絲，置研缽內(nèi)加入液氮后研磨。利用真菌基因組提取試劑盒(UNlQ-10，上海生工，中國)抽提基因組DNA。

1.3.2SDH基因擴(kuò)增測序 根據(jù)Broad Institute (http://www.broadinstitute.org)公布的灰葡萄孢菌株(B.fuckelianaB05.10)基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計SdhA、SdhB、SdhC及SdhD基因的擴(kuò)增引物。引物序列如下：SdhA為SdhAF(5′-ATGTCTTCATTTGCTATGCGTAGATTC-3′)和SdhAR(5′-CTATCCATTTTCATCTTTAGTGACCTTC-3′)；SdhB為SdhBF(5′-ATGGCTGCTCTCCGCACAGGTGCCCGC-3′)和SdhBR(5′-TTAGAAAGCCATTTCCTTCTTAATCT- C-3′)；SdhC為SdhCF(5′-ATGTTTTCACAGAGAGCAACTCAACAAT-3′)和SdhCR(5′-CTACAAGAAAGCAACCAACGCCAAAGCAC-3′)；SdhD為SdhDF(5′-ATGGCTTCATTCATCAAACCATCCGTC-3′)和SdhDR(5′-TTATGCGCGCCAAATTCTTTTGATACC-3′)。 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。

1.3.3SDH基因比對分析 測序結(jié)果用軟件DNAMAN 6.0進(jìn)行序列比對，分析發(fā)生突變的氨基酸的數(shù)量和位置，以明確突變類型與抗性表型的關(guān)系。

1.4 適應(yīng)性評估

1.4.1 菌絲生長速率測定 為了進(jìn)行適應(yīng)性評估，選擇不同抗性水平菌株各10個，對其菌絲生長速率、分生孢子萌發(fā)率以及致病性進(jìn)行分析，參照Veloukas等[17]報道的方法進(jìn)行。將直徑5 mm菌餅接種于新的PDA平板上，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，利用十字交叉法分別測量每個菌落直徑，然后計算其平均值。每個菌株設(shè) 3 個重復(fù)。

1.4.2 分生孢子萌發(fā)率測定 PDA平板上培養(yǎng)的菌株置于22 ℃黑暗培養(yǎng)15 d。然后每個平板加入10 mL無菌水，用玻片輕輕刮起制備分生孢子懸浮液。經(jīng)過 4 層無菌紗布過濾后，配制分生孢子懸浮液濃度為1×106mL-1，備用。然后取20 μL分生孢子懸浮液置于含有不同質(zhì)量濃度啶酰菌胺的培養(yǎng)基平板上，于22 ℃黑暗放置16 h后，按Veloukas等[17]的方法鏡檢芽管萌發(fā)。每個菌株設(shè) 3 個重復(fù)。

1.4.3 致病性測定 取20 μL分生孢子懸浮液接種番茄果實，發(fā)病后測量病斑大小，計算病情指數(shù)。每個菌株接種3個健康番茄果實，試驗重復(fù)2次。具體操作參照李培謙等[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄灰葡萄孢菌株對啶酰菌胺的敏感性

菌絲生長速率試驗表明，運(yùn)城地區(qū)分離的105個番茄灰葡萄孢EC50值為0.40～132 μg/mL，根據(jù)敏感基線1.07 μg/mL[15]，81個菌株表現(xiàn)抗性，EC50值為10.92～132 μg/mL； 24個為敏感菌株，EC50值為0.4～9.94 μg/mL，占供試菌株的77.14% (表1)。根據(jù)抗性水平劃分標(biāo)準(zhǔn)[16]，81個菌株被劃分為不同的抗性水平類型，其中17個菌株EC50值>115 μg/mL，為高抗；36個菌株EC50值為53.6～103.2 μg/mL，為中抗；28個菌株EC50值為10.92～52.8 μg/mL，為低抗(圖1)。根據(jù)運(yùn)城市各地區(qū)番茄灰葡萄孢對啶酰菌胺抗性水平分析發(fā)現(xiàn)，鹽湖區(qū)、夏縣、臨猗、永濟(jì)和萬榮的抗性頻率分別為82%、65.2%、65%、81%和81.3%(圖2)，其中高抗菌株頻率最高的地區(qū)為永濟(jì)，達(dá)到25.4%，表明運(yùn)城地區(qū)番茄灰葡萄孢已經(jīng)出現(xiàn)明顯的抗藥性。

表1 105個番茄灰葡萄孢菌株對啶酰菌胺抗性測定Table 1 Resistance to boscalid of 105 B.cinerea isolates from tomato

圖1 番茄灰葡萄孢對啶酰菌胺EC50值范圍Fig.1 EC50values of Botrytis cinerea isolates from tomato rejected to fungicide boscalid

圖2 不同地區(qū)番茄灰葡萄孢對啶酰菌胺抗性頻率Fig.2 Regional distribution frequency of totnato Botrytis cinerea isolates resistant to boscalid

2.2 番茄灰葡萄孢SDH基因比對分析

選擇不同抗性水平的菌株進(jìn)行SdhA、SdhB、SdhC和SdhD基因克隆測序及序列比對分析。結(jié)果表明(圖3)，所選10個敏感性菌株的SdhA、SdhB、SdhC和SdhD基因均與野生型灰葡萄孢菌株(B.fuckelianaB05.10)SDH基因序列一致，表明沒有發(fā)生突變。而選測的30個抗性菌株的序列比對結(jié)果顯示，SdhA、SdhC和SdhD均未發(fā)生突變，僅在SdhB基因發(fā)生點突變，272位組氨酸(H)突變?yōu)榫彼?R)，而且突變類型與菌株抗性水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性。

供試菌株SdhB基因的擴(kuò)增序列與野生型菌株的序列比對 Sequences alignment ofSdhBgene from selected isolates and wild type isolate. A.B.cinerea菌株 02-389 (AY726619) 和B.cinerea菌株 yc1(KT254306) 源于NCBI數(shù)據(jù)庫的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，為野生型菌株, FQBC10為供試的敏感性菌株B.cinereastrain 02-389 (AY726619) andB.cinereastrain yc1(KT254306) downloaded from GenBank at NCBI Database ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov ) were used as wide-type isolate, FQBC10 was sensitive isolate; B.供試菌株均為低抗型，突變位點為272氨基酸，CAC突變?yōu)镃GC Lowly resistant isolate, 272 mutation, CAC changed to CGC;C.參試菌株均為中抗型，突變?yōu)辄c為272氨基酸，CAC突變?yōu)镃GC Moderate resistant isolate, 272 mutation, CAC changed to CGC; D.供試菌株均為高抗型，突變?yōu)辄c為272氨基酸，CAC突變?yōu)镃GC Highly resistant isolate, 272 mutation, CAC changed to CGC.

圖3 對啶酰菌胺不同抗性的番茄灰葡萄孢菌株的SdhB序列比對
Fig.3 Sequences alignment ofSdhBamony tomatoBortytiscinereaisolates with different resistance to boscalid

2.3 適應(yīng)性評估

抗性菌株與敏感性菌株的菌絲生長速率、分生孢子萌發(fā)率以及致病性均存在明顯差異(表2)。相同培養(yǎng)條件下，抗性菌株菌絲生長速率明顯比敏感性菌株高，而不同抗性水平的菌株之間菌絲生長速率無明顯差異。敏感性菌株與突變型菌株產(chǎn)孢量不同。但是敏感菌株分生孢子萌發(fā)率最高達(dá)到94.72%，而突變菌株分生孢子萌發(fā)率也較高，達(dá)91%以上。所有供試菌株均能侵染番茄果實發(fā)病，并且敏感性菌株與抗性菌株的致病力存在差異，引起的番茄果實病斑大小顯著不同。

3 結(jié)論與討論

番茄灰霉病是溫室番茄栽培中的常見病害，冬春季節(jié)低溫高濕環(huán)境更利于該病害的發(fā)生流行。目前，番茄灰霉病防治主要依賴于化學(xué)藥劑，啶酰菌胺因其殺菌普廣，作用效果強(qiáng)，被作為推薦用藥之一[2]。但是，隨著啶酰菌胺的使用次數(shù)和使用量不斷增加，導(dǎo)致灰葡萄孢對其產(chǎn)生不同程度的抗藥性。已有歐美多個國家報道田間灰葡萄孢(B.cinerea)對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性[10-13]。目前已有部分學(xué)者報道國內(nèi)蔬菜水果對啶酰菌胺的抗性發(fā)生。石延霞等[18]報道華北地區(qū)蔬菜作物灰葡萄孢對啶酰菌胺產(chǎn)生較高水平的抗藥性，抗性頻數(shù)達(dá)到65.88%。劉欣等[19]發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)草莓灰葡萄孢對啶酰菌胺的抗性水平及抗性頻率較高，高抗菌株頻率達(dá)到20.51%。本研究對運(yùn)城地區(qū)番茄灰葡萄孢抗性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株達(dá)到77.14%，說明運(yùn)城地區(qū)番茄灰霉病對啶酰菌胺的抗藥性已經(jīng)很普遍。

表型Phenotype菌絲直徑/cmHyphal diameter產(chǎn)孢(×106)/mL-1Sporulation分生孢子萌發(fā)率/%Percent of condinial germination病斑/cmLesion敏感菌株 Sensitive isolate6.05 ± 0.36 a6.73 ± 0.47 a94.72 ± 0.83 a1.62 ± 0.06 a高抗菌株 Highly resistant isolate6.81 ± 0.41 b6.16 ±0.65 b92.64 ± 1.05 bc1.65 ± 0.08 a中抗菌株 Moderate resistant isolate6.90 ± 0.34 b6.93 ± 0.32 a91.32 ± 2.43 b1.54± 0.15 bc低抗菌株 Lowly resistant isolate7.07 ± 0.27 b6.15 ± 0.89 b93.05 ± 2.06 c1.55 ± 0.12 c

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The different lowercases letters represent significant difference in same column(P<0.05).

運(yùn)城不同地區(qū)的番茄灰葡萄孢菌株對啶酰菌胺的抗性頻率差異較大，這與溫室耕作及作物連作栽培管理有關(guān)。在采樣過程中，筆者了解到鹽湖區(qū)部分溫室夏季栽培番茄，秋冬仍然栽培番茄，連作為灰葡萄孢提供休眠繁衍的場所，也增加農(nóng)藥使用頻率，使灰葡萄孢更易產(chǎn)生抗藥性。而臨猗和夏縣的溫室夏季大多栽培西瓜，秋冬栽培番茄黃瓜，在一定程度上減少了灰葡萄孢的發(fā)生次數(shù)。因此，病害防治應(yīng)堅持以加強(qiáng)栽培管理為主的綜合防治策略。

國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抗藥性產(chǎn)生源于病原菌基因發(fā)生點突變，主要是琥珀酸脫氫酶SdhB亞基272位組氨酸(H)突變?yōu)榫彼?R)、酪氨酸(Y)或酪氨酸(L)，但H272R常見[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)該基因的225位脯氨酸發(fā)生突變P225L/F/T[12]。國內(nèi)學(xué)者劉欣等[19]報道上海地區(qū)草莓灰葡萄孢抗性與琥珀酸脫氫酶SdhB亞基發(fā)生H272R或P225F突變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)番茄灰葡萄孢抗性菌株SdhB亞基發(fā)生H272R突變，未見其他類型突變。并且基因突變與菌株抗性水平?jīng)]有明確的關(guān)系，這與前人研究結(jié)果一致[14]。

適應(yīng)性可以被定義為等位基因、個體或群體的存活和繁殖成功[20]?？剐跃甑倪m應(yīng)性是影響抗性產(chǎn)生、進(jìn)化或衰退風(fēng)險的重要因素。真菌種群中抗藥性的進(jìn)化在很大程度上取決于菌株的適應(yīng)性，分析適應(yīng)性對病害管理有重要意義[21]。對QoIs類殺菌劑具有單一抗性的灰葡萄孢未產(chǎn)生任何適應(yīng)性變化[22-23]。而Veloukas等[17]認(rèn)為啶酰菌胺抗性灰葡萄孢產(chǎn)生的適應(yīng)性變化是由于SdhB亞基突變引起的。Laleve等[24]報道具有多個SdhB基因發(fā)生H272R 及P225L突變的灰葡萄孢產(chǎn)生了適應(yīng)性變化。本研究中發(fā)現(xiàn)抗性菌株SdhB基因發(fā)生H272R突變，與野生型和敏感型菌株相比在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率以及致病性上都發(fā)生明顯變化，這與前人研究結(jié)果一致[17，24]。

本研究分析運(yùn)城地區(qū)番茄灰葡萄孢對啶酰菌胺的抗藥性，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)番茄灰葡萄孢菌株普遍產(chǎn)生了抗藥性，抗性頻率達(dá)到77.14%。對抗性菌株進(jìn)行靶標(biāo)位點基因測序分析，發(fā)現(xiàn)抗性產(chǎn)生主要是由于琥珀酸脫氫酶SdhB亞基發(fā)生H272R突變，未發(fā)現(xiàn)SdhA、SdhC或SdhD突變。并且不同抗性水平的菌株SdhB亞基突變類型一致。適應(yīng)性分析發(fā)現(xiàn)，敏感菌株與抗性菌株在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率以及致病性方面都存在明顯差異?？鼓退幉呗灾荚谕ㄟ^降低使用屬于不同化學(xué)類別殺菌劑的抗性基因的速率來減緩耐藥頻率。不同殺菌劑與SDHI交替應(yīng)用有助于降低抗性頻率。生產(chǎn)中不同的SDHIs交替可能增加交叉抗性基因型的頻率，因此需要強(qiáng)調(diào)正確的用藥方案和使用適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藥混配的重要性。本研究對于分析灰葡萄孢抗藥性機(jī)制及SDHI類殺菌劑抗藥性分析提供理論支持，為農(nóng)藥抗性分子生物學(xué)分析提供重要理論依據(jù)。同時對于科學(xué)使用農(nóng)藥及進(jìn)一步抗藥性監(jiān)測提供方法。