方翟 ，馬小龍 ，高慶華 ＊

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

綿羊主要組織相容性復合體，又稱為綿羊淋巴細胞表面抗原，存在于20號染色體上，是由Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類區(qū)域組合而成，多態(tài)性較高。前人研究結果表明，在Ⅱ類區(qū)域的DQ和DR亞區(qū)多態(tài)性集中[1]。其第2外顯子為功能區(qū)，因此MHC的研究集中在DRB3基因第2外顯子上[2]。

MHC分子可作為動物抗病力的遺傳標記，主要原因在于眾多研究表明其多態(tài)性與家畜的抗病、易感性高度相關性[3]。MHC分子可以用來作為一個候選標記基因的抗病性，是由于它的抗原呈遞和對動物的免疫調節(jié)作用，它是動物抗病育種和免疫遺傳學中的活躍部分[4-5]。MHC基因的高度多態(tài)性在疾病抗性及生殖調控中發(fā)揮著十分重要的作用，因此MHC基因已成為全球免疫學家的廣泛研究對象。1998年Hedrick首次利用MHC基因用檢測了瀕危物種的自然種群的遺傳變異。其后該基因被廣泛用于種群進化、自然選擇、近交衰退、生存及繁殖的適應性等研究[6]。另外，MHC的多態(tài)性是一種遺傳性狀，家畜任一經濟性狀的遺傳都受其控制，控制MHC遺傳性狀的基因可能會有某種直接或間接的聯系，如能發(fā)現這種聯系，就可能應用MHC的多態(tài)性來進行優(yōu)良個體的選育或品種的改良。對動物MHC遺傳多樣性的研究，可以為畜禽遺傳資源的保護和利用提供依據。

MHC基因在機體免疫系統(tǒng)上的重要作用，讓它成為家畜抗遺傳育種的研究熱點。脊椎動物中MHC基因的突出特點是多態(tài)程度高而且多堿基突變。近幾年來，國內與綿羊MHC-DRB3基因相關的研究陸續(xù)出現，2002年劉云芳應用PCR -RFLP方法對新疆部分綿羊品種MHC-DRB3基因的遺傳多態(tài)性進行了研究[7]；尚友國（2005）分析了山東四個地方綿羊品種DRB3基因的多態(tài)性[8]；楊易等人（2006）對四川四個地方綿羊群體MHC-DRB3外顯子2的多態(tài)性也進行了研究[9]；另外，吐爾孫江·努爾麥麥提對新疆部分綿羊品種MHC-DRB3基因遺傳多態(tài)性研究中在和田羊的41個序列中共發(fā)現290個突變位點、在塔什庫爾干羊的32個序列中共發(fā)現203個突變位點[10]，他們的結果都表明綿羊MHC-DRB3基因的多態(tài)性非常豐富。

本研究通過直接測序的方法對多浪羊的MHCDRB3基因第2外顯子進行序列檢測和分析，了解多浪羊DRB3基因的多態(tài)性分布情況，并期望能篩選出幾個能夠作為遺傳標記的多態(tài)位點。為今后多浪羊MHC-DRB3基因多態(tài)性的進一步研究和多浪羊的育種提供理論以及技術上的參考加快多浪羊遺傳育種的進展。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

在塔里木大學動物科學學院實驗站選取23只多浪羊。多浪羊頸靜脈無菌采血10mL/只，肝素鈉抗凝，低溫保存帶回實驗室備用。

1.1.2 PCR引物設計

參考劉云芳等[7]的文獻以及GenBank數據庫綿羊MHC-DRB基因Z11520序列，利用PrimerPremier5.0和OLIGO6.0軟件進行DRB3基因第二外顯子的引物設計，目的片段309bp；引物是由上海生工生物技術公司合成。

PrimerDRB3-F:5′-TCCTCATTAGCCTCTCCCCA-3′

PrimerDRB3-R:5′-TGGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′

1.1.3 主要試劑

引物、2×PCRMix、血液基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技北京有限公司；瓊脂糖、2000DNAMarker、DNALoadingBuffer等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增體系

PCR反應體系見表1。

表1 PCR反應體系

1.2.2 PCR擴增條件

94℃預變性 4 min；94℃變性 30s、60℃復性30s、72 ℃延伸 1 min，72℃延伸 10 min，35 個循環(huán)。

將檢驗合格的PCR產物編號，放置于有冰袋的泡沫箱子中，密封，寄送到上海生工生物工程有限公司上海測序部，雙通測序。

2 結果及分析

2.1 DNA提取結果

按照血液基因組DNA提取試劑盒的提取要求將采集到的多浪羊血樣進行DNA提取，將提取物在EB中染色后在凝膠成像檢測儀內檢測，得到一條DNA條帶，見圖1。

圖1 多浪羊DNA提取結果

（1-10為血液DNA提取物）

2.2 PCR擴增結果

對23個多浪羊DNA樣液中的MHC-DRB3基因進行PCR擴增，擴增產物經EB染色后在凝膠成像檢測儀內檢測，結果得到了一條約309bp的特異性條帶，見圖2。

圖2 多浪羊MHC-DRB3基因的PCR擴增結果

2.3 測序結果

2.3.1 DRB3基因序列比對結果

用DNAMAN6.0軟件對23只多浪羊的同源性比較結果表明，23個序列之間的同源性在90%以上，見圖3。

圖3 DRB3基因序列檢測

多浪羊DRB3基因第2外顯子序列中，A、T、C、G 4種堿基的比例分別為22.5%、19%、24.1%和34.4%，GC的含量明顯高于AT。包括46個突變位點，其中堿基置換22個。

4 分析與討論

本試驗利用直接測序DR技術測定23只多浪羊的DNA序列，發(fā)現46個突變位點，說明MHC-DRB3基因在多浪羊中的多態(tài)性極為豐富。這個結果可能與所檢測的多浪羊的來源有關，各多浪羊來源于南將各個區(qū)域，存在地域差異。但本試驗用直接測序法得到的試驗結果表明，多浪羊MHC-DRB3基因的多態(tài)性極為豐富，它能夠在品種水平上反映多浪羊種內的遺傳差異。

5 結論

本研究對23只多浪羊的MHC-DRB3第2外顯子基因測序分析結果表明，多浪羊的MHC-DRB3基因第2外顯子在種內具有較高的多態(tài)性。