小鼠抗家兔胰島細胞多克隆抗體的制備及鑒別

吳國娣，蔣煊，徐福遠，吳嵐嵐，陳佳妮，傅紅興＊

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江溫州 325035；2.義烏市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，浙江義烏 322000）

抗體（Antibody）是現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要組成成分，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)診斷等方面有廣泛的應(yīng)用?？贵w通常是機體由于抗原的刺激而由效應(yīng)B細胞分泌產(chǎn)生的具有保護作用的蛋白質(zhì)，能識別特定外來物，即抗原[1]。多克隆抗體能識別任一抗原上的多個表位，允許抗原有微小的變化，且制備所需技術(shù)和技能不高，制備時間短，因此市場上品種很多[2]。本研究采用家兔胰島細胞團為抗原，進行Balb/c小鼠接種，生產(chǎn)小鼠抗家兔胰島細胞的特異性多克隆抗體，為該蛋白用于免疫組化法鑒定家兔胰島和免疫磁珠分離胰島等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性新西蘭大白兔，6～8周，體重為2.5～3.0 kg；雌性Balb/c小鼠，5～6周（溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。

1.1.2 試劑和實驗器材

Ⅴ型膠原酶、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（Sigma公司，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL 1066培養(yǎng)液（溫州怡康細胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；胎牛血清（四季青公司）；牛血清白蛋白BSA（北京博爾西科技有限公司）；Hanks液（自配）；NIKON YS100顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；L-500臺式低速多管架自動平衡離心機（上海利鑫堅離心機有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（Thermo電子儀器有限公司）；scientz-IID超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 家兔胰島的分離

結(jié)合文獻報道[2-3]，家兔胰島分離方法簡述如下。選取新西蘭大白兔一只，稱重，耳緣靜脈注射10%水合氯醛2.5～3.2 mL/kg麻醉后，腹部、頸部依次剃毛和消毒。沿腹白線打開腹腔，將腸管推向腹腔右側(cè)，沿十二指腸下行至小腸部位，找到總胰管，用動脈夾夾閉總胰管至小腸入口，防止灌注膠原酶時將其灌入小腸；破心處死家兔，用留置針進行胰管插管和灌注0.8 mg/mL膠原酶Ⅴ約40 mL，待胰腺充分膨脹后，用眼科剪和鑷子沿小腸壁、十二指腸壁和胃壁處快速完整剝離膨脹的胰腺組織。將其略剪碎后放置于含5 mL相同濃度膠原酶的2只50 mL離心管中，在（37.0±0.5）℃恒溫水浴中上下柔和振搖消化，至胰腺組織消化至乳糜和泥沙狀（3～4 min），分別加入35 mL的4℃ Hanks液終止消化。用Hanks液洗滌3次；往洗滌后的離心管分別加入10 mL Ficoll-1119，蝸旋混合后，再分別向兩管依次貼壁緩慢加入5 mL Ficoll-1077 溶液和 5 mL Hanks溶液，離心機 2000 r/min離心5 min；吸取兩管的上層清液倒至另兩只新的50 mL離心管中洗滌胰島組織3次，必要時將其帶入細胞房進行進一步手工純化。

將挑選所得的全部胰島細胞團計數(shù)并快速轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用CMRL 1066培養(yǎng)液（加胎牛血清和鏈霉素），在37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠免疫接種

將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，用移液槍將胰島細胞團轉(zhuǎn)移到2 mL的EP管中，1000 r/min離心 5 min，盡量棄去上層培養(yǎng)液，加入200 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，重復(fù)洗滌2次。在洗滌完的EP管中加入200 μL磷酸鹽緩沖液，再加入等體積弗氏完全佐劑，用超聲波細胞粉碎機進行乳化，將乳化好的抗原滴入冷水中進行檢測，無油滴打散即符合要求。

采用Balb/c小鼠作為免疫動物，小鼠做免疫接種前采集血樣以作陰性對照，在小鼠腹股溝，頸部皮下，背部皮下分散4～6點注射，每點0.1 mL。每隔7天用磷酸鹽緩沖液和弗氏不完全佐劑1∶1混勻乳化后加強免疫一次。

1.2.3 提取抗體

免疫5次后從小鼠尾靜脈取1 mL血液，靜置60 min后 10000 r/min離心 15 s分離得到小鼠血清，進行抗體檢測。

1.2.4 抗體檢測

采用家兔胰腺組織的免疫組化染色鑒別多克隆抗體。

1.2.4.1 HE染色

取新鮮家兔胰腺組織，用4%多聚甲醛固定24 h；常規(guī)進行脫甲醛、脫水、石蠟包埋、切片后，進行伊紅和蘇木精染色，用中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4.2 免疫組化染色

取新鮮家兔胰腺組織，用4%多聚甲醛固定24 h；常規(guī)脫甲醛、脫水、石蠟包埋、切片后， 用3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶、胰酶修復(fù)、BSA封閉抗原；將收集的小鼠抗家兔胰島細胞血清用1%BSA稀釋200倍，并覆蓋在組織上4℃濕盒孵育過夜；再加入山羊抗小鼠IgG在37℃烘箱中孵育1 h，用1∶20DAB染液滴加至組織處，于鏡下觀察染色，用蘇木素染核2～3 min，中性樹脂封片；顯微鏡下觀察并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔胰島分離結(jié)果

純化后的家兔胰島細胞形態(tài)圓整，大小不一，整體狀態(tài)較好；培養(yǎng)后的胰島細胞形態(tài)更圓整。一只家兔所能分離的胰島細胞團個數(shù)在3700～4700個，與文獻報道的一致[3-4]。

2.2 HE染色和免疫組化結(jié)果對比

取家兔胰腺組織進行HE染色和小鼠抗家兔胰島細胞多克隆抗體的免疫組化研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 家兔胰腺組織的免疫組化（a）和HE染色（b）結(jié)果（×400）

由圖1可知，該家兔胰腺組織在胰島部位的染色呈陽性，免疫組化結(jié)果和HE染色結(jié)果一致性，而且外分泌腺組織不染色，說明采用本方法制備得到的小鼠抗家兔多克隆抗體有較好的特異性。

3 結(jié)論

胰島細胞抗體（ICA）在糖尿病及胰島功能相關(guān)免疫學(xué)研究中有很高的應(yīng)用價值[5-6]。在本實驗前期研究中，取家兔胰島細胞對小鼠進行免疫接種，每隔7天免疫一次，在5周后通過免疫組化方法進行抗體鑒定時，發(fā)現(xiàn)使用不稀釋的血清作為一抗進行免疫組化實驗時，濃度過大，無法清晰、有效地進行染色，后來改用血清稀釋200倍，染色效果最好。

總之，用家兔胰島細胞多次免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生胰島細胞抗體，同時通過免疫組化方法進行抗體的鑒定的方法是有效可行的。但更確信的結(jié)論還有賴于更多的試驗探索。