周津，王代芳，鐘碧萍

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州 350002）

游離DNA（cfDNA）作為血液及體液中的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)癌癥患者的早期診斷具有較高的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。常規(guī)的cfDNA檢測方法[3-6]有放射性免疫分析法、聚合酶鏈反應(yīng)法、酶聯(lián)免疫吸附法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，但這些方法有的檢測成本較高，有的方法復(fù)雜且需要特殊儀器，不適合大規(guī)模人群的初篩。DNA利用自組裝形成串聯(lián)體作為信號(hào)放大機(jī)制被廣泛關(guān)注[7-9]。血糖儀具有體積小便攜、檢測成本低、定量準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是最成功的便攜式儀器[10]。本文以DNA串聯(lián)體作為信號(hào)放大系統(tǒng)，血糖儀作為檢測器，構(gòu)建一種快速篩查腫瘤標(biāo)志物cfDNA的便攜式傳感器。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蔗糖（阿爾法埃莎中國有限公司）；Sulfo-SMCC，TCEP，蔗糖轉(zhuǎn)化酶和吐溫-20（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉（分析純，上海化學(xué)試劑公司）；鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子(SA-PMPs)（美國普洛麥格公司）。

DNA均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成及純化（中國上海），序列如下（從左到右:5’到3’）:

3’-生物素修飾的捕獲DNA:TGCAGCTCATGCC AAAAAAAAA- Biotin

目標(biāo)DNA:GGCATGAGCTGCATGATGAGCTG

3’-巰基修飾的信號(hào)DNA:TACTCCCCCAGGTGCC AGCTCATCA- SH

附加探針AP:GCACCTGGGGGAGTATGATGAGCTG

本實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ的超純水，所用緩沖溶液配制如下:（1）緩沖溶液A:0.1 M氯化鈉，pH為7.4的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液， 0.05%的吐溫-20。（2）緩沖溶液B:0.1 M氯化鈉，pH為7.4的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液。（3）1.0 M的蔗糖溶液用緩沖溶液A（pH=7.4）配制并儲(chǔ)存于4 ℃待用。

Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA）；PHS-3C型精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；FINNPIPETTE 可調(diào)式移液器（上海熱電儀器有限公司）；TGL-16 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；羅氏羅康全血糖儀及其配套試紙Roche ACCU-CHEK?Active羅氏羅康全活力 2 型（德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 捕獲探針（CP-PMPs）的制備

（1）移取0.6 mL濃度為1 mg/mL的修飾有鏈霉親和素的磁珠（SA-PMPs），用緩沖溶液B洗滌3次后重新溶解于0.6 mL的緩沖溶液B中。加入生物素修飾的捕獲DNA并將混合物置于搖床上室溫振蕩1 h。（2）用緩沖溶液B洗滌磁珠3次并溶解于適量緩沖溶液B中，即配制成終濃度為20 μM的捕獲探針母液（CP-PMPs）。由于鏈霉親和素和生物素之間具有強(qiáng)親和力的特異性結(jié)合作用[11]，因此修飾有生物素的捕獲DNA能被固定結(jié)合在修飾有鏈霉親和素的磁珠SA-PMPs表面。（3）用磁鐵吸附混合溶液中捕獲DNA與SA-PMPs反應(yīng)所生成的磁珠復(fù)合物，并進(jìn)一步用緩沖溶液B洗滌此磁珠復(fù)合物3次。（4）將洗滌后的磁珠復(fù)合物重新分散于緩沖溶液B中并儲(chǔ)存于4 ℃待用。

1.2.2 信號(hào)探針（SP-酶）的制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12]合成蔗糖轉(zhuǎn)化酶標(biāo)記的信號(hào)探針（SP-invertase）。制備步驟簡述如下:首先移取30 μL濃度為100 μM的巰基修飾的信號(hào)DNA溶解于超純水中，再加入2 μL濃度為3 mM的TCEP和 20 μL pH=5.5、濃度為 10 mM 磷酸鹽緩沖溶液，將混合溶液在室溫下反應(yīng)1 h。最后，將反應(yīng)混合物用緩沖溶液A透析得到活化后巰基修飾的信號(hào)DNA。為了使蔗糖轉(zhuǎn)化酶共價(jià)鍵接到信號(hào)DNA上，移取800 μL濃度為10 mg/mL的蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液并稱取1 mg的Sulfo-SMCC同時(shí)加入到緩沖溶液B中，將其混合并渦旋5 min后，將混合物置于搖床上在室溫下振蕩1 h。隨后用離心機(jī)進(jìn)行離心分離，除去未溶解的Sulfo-SMCC。取上清液中用Sulfo-SMCC修飾后的蔗糖轉(zhuǎn)化酶溶液與上述活化后的信號(hào)DNA在室溫下混合孵化48 h。為了移去未反應(yīng)的信號(hào)DNA，將混合溶液用緩沖溶液A透析即得到純化后的信號(hào)探針（SP-invertase）。

1.2.3 目標(biāo)物的檢測

取適量信號(hào)探針（SP-invertase）、捕獲探針（CP-PMPs）和附加探針（AP）加入緩沖溶液B（pH=7.4）中，配成捕獲探針、信號(hào)探針和附加探針終濃度為4 μM、總體積為30 μL的測試溶液。在體系中，附加探針與信號(hào)探針首先自組裝形成長串的蔗糖轉(zhuǎn)化酶標(biāo)記的DNA串聯(lián)體，在沒有目標(biāo)DNA存在的條件下，串聯(lián)體不能結(jié)合到磁珠上，所檢測到的血糖儀信號(hào)極低，同時(shí)可以觀察到血糖試紙背面的比色窗口顏色沒有明顯的變化。當(dāng)體系中加入不同濃度的目標(biāo)DNA并在黑暗室溫條件下孵化1.5 h后，目標(biāo)DNA與信號(hào)探針與捕獲探針之間發(fā)生強(qiáng)有力的親和作用，形成具有穩(wěn)定的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)。隨后，用磁鐵分離出體系中的磁珠-蔗糖轉(zhuǎn)化酶串聯(lián)體復(fù)合物。使用50 μL緩沖溶液B進(jìn)一步洗滌固定在磁珠表面的蔗糖轉(zhuǎn)化酶串聯(lián)體復(fù)合物3次，并將其最終溶解于10 μL的緩沖溶液B中。然后，向上述溶液中小心加入20 μL濃度為1.0 M的蔗糖溶液，并在45 ℃下孵化20 min。此時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖水解生成葡萄糖并能被血糖儀檢測到。需要注意的是，在到達(dá)20 min時(shí)立即將測試溶液置于100 ℃水浴鍋中滅活。采集在加入目標(biāo)DNA前后血糖儀信號(hào)的變化數(shù)據(jù)用于定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響

考察了探針與目標(biāo)DNA的特異性結(jié)合時(shí)間（0～3 h）對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)反應(yīng)1.5 h之后體系的ΔS趨于穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選取反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。

圖1 兩種探針與目標(biāo)DNA特異性結(jié)合時(shí)間對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值的影響

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響

考察了酶催化反應(yīng)溫度（25～60 ℃）對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)酶催化反應(yīng)溫度低于45 ℃時(shí)，酶催化效果隨溫度上升而增強(qiáng)，并在45 ℃時(shí)達(dá)到最佳酶催效果；在超過45 ℃后，酶催化效果大幅下降，說明高溫可能會(huì)使酶部分失活，不利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。故本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為 45 ℃。

圖2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖水解反應(yīng)溫度對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值的影響

2.3 探針濃度對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響

考察了0～6.0 μM探針的反應(yīng)濃度對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響，結(jié)果如圖3所示。我們選擇探針濃度分別為1.0μM，2.0μM，3.0μM，4.0μM，5.0μM，6.0μM，由血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值可知，隨著濃度的增加其響應(yīng)值也逐漸增大，在4.0-6.0μM范圍內(nèi)，響應(yīng)值趨于平緩，由此選擇4.0μM的探針濃度。

圖3 探針濃度對(duì)血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS的影響

2.4 校準(zhǔn)曲線

在選定實(shí)驗(yàn)條件下，在1～316 fM的范圍內(nèi)，血糖儀信號(hào)增強(qiáng)值ΔS與目標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔS=3.7859lgC+8.6332，相關(guān)系數(shù)為0.9986，檢出限可達(dá)1fM（圖4），低于很多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法。選擇目標(biāo)DNA濃度為100 fM時(shí)，重復(fù)制備五組傳感器進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%。表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

圖4 目標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)值與血糖儀信號(hào)的增強(qiáng)值間的校正曲線

3 結(jié)論

cfDNA作為腫瘤標(biāo)志物引起了廣泛的關(guān)注與研究，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種基于血糖儀的便攜式傳感器，利用DNA串聯(lián)體構(gòu)建信號(hào)放大系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度cfDNA的快速檢測，為癌癥的早期篩查與檢測提供了一種新方法。