鐘焱　徐慧　彭鳳蘭

[摘要] DNA甲基化修飾作用是目前表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。其參與基因表達(dá)調(diào)控、基因沉默、DNA損傷修復(fù)以及癌癥發(fā)生等重要生物學(xué)過程，大多癌癥的致病過程、免疫系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病等疾病都涉及表觀遺傳學(xué)改變，基因的甲基化主要發(fā)生在富含GC堿基序列的CpG區(qū)域，基因在相應(yīng)的甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下調(diào)控癌基因、致癌基因的表達(dá)和DNA的損傷修復(fù)等。本文結(jié)合最新研究進(jìn)展綜述DNA甲基化在基因組中的基因表達(dá)調(diào)控中的意義及研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞] 啟動(dòng)子;甲基化;基因表達(dá)調(diào)控

[中圖分類號(hào)] R34 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（b）-0033-04

[Abstract] DNA methylation modification is a hot research topic in epigenetics. Its involved in regulating gene expression， gene silencing， DNA damage repair， and cancer， and other important biological processes， most of the pathogenic process of cancer， immune system diseases， Alzheimer′s disease are involved in epigenetic changes， gene methylation is mainly in the areas rich in GC base sequence of the CpG， gene under the action of the corresponding methylation transferase regulate the expression of cancer gene， oncogene and DNA damage repair， etc. In this paper， the significance and research progress of DNA methylation in gene expression regulation in genome were reviewed.

[Key words] Promotor; Methylation; Gene expression regulation

表觀遺傳學(xué)指基因的核酸序列不發(fā)生改變的情況下基因的表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳改變的現(xiàn)象，甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾作用，它可在不改變基因序列的前提下，對(duì)基因序列中的堿基進(jìn)行甲基基團(tuán)修飾，以此抑制或促進(jìn)基因的表達(dá)而影響機(jī)體功能，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的修飾方式，與癌癥、衰老、免疫系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，是表觀遺傳學(xué)的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容[1-2]。如結(jié)直腸癌細(xì)胞中有許多異常的甲基化基因，主要包括非啟動(dòng)子區(qū)域的總體低甲基化和啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化[3]，基因低水平甲基化或去甲基化可激活基因的表達(dá)，導(dǎo)致癌基因表達(dá)上調(diào)或細(xì)胞染色體空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;基因高水平甲基化則關(guān)閉或沉默某些基因的活性，使得抑癌基因表達(dá)下調(diào)或DNA損傷修復(fù)受抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等功能。

1 DNA甲基化與基因表達(dá)

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程，可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳動(dòng)物的DNA甲基化主要發(fā)生在G/C含量豐富的5′-CpG-3′序列的C堿基上。人類的CpG以兩種形式存在，一種是分散于DNA序列中，另一種是CpG結(jié)構(gòu)高度聚集的CpG島，在正常組織里，70%～90%散在的CpG是被甲基修飾的。

DNA甲基化通過甲基化堿基序列而影響核酸空間構(gòu)象、穩(wěn)定性及其與蛋白質(zhì)相互作用方式等，起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。一般情況下，基因啟動(dòng)子CpG島甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，基因內(nèi)部的甲基化與基因表達(dá)也存在著弱的負(fù)相關(guān)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要包含5種類型的DNA甲基化酶（DNA methyl transferase，DNMT），分別是DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三種酶具有甲基轉(zhuǎn)移活性，分為持續(xù)性甲基轉(zhuǎn)移酶和從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，前者主要是DNMT1，它能使DNA雙鏈其中的一條鏈完全甲基化，參與DNA復(fù)制過程中新合成鏈的甲基化;后者主要包括DNMT3A和DNMT3B，在早期哺乳動(dòng)物胚胎中高表達(dá)，但在細(xì)胞分化過程中表達(dá)降低，主要甲基化人類基因中CpG序列，使其半甲基化，繼而全甲基化。有研究[4-6]認(rèn)為從頭甲基轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)控，其中DNMT3A以自抑制的形式存在，且組蛋白H3尾部可促進(jìn)及誘導(dǎo)其活性參與細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞分化。

2 基因甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)調(diào)控的方式及意義

2.1 甲基化啟動(dòng)基因序列，導(dǎo)致基因沉默

啟動(dòng)子是基因表達(dá)與否的“開關(guān)”，是基因表達(dá)過程中RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合的部位，富含GC序列并組成很多CpG島，啟動(dòng)子中的DNA甲基化通過招募參與基因阻遏的蛋白質(zhì)后抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而沉默或抑制基因表達(dá)，是甲基化抑制劑假定的治療靶點(diǎn)。眾多腫瘤的一個(gè)重要特征是對(duì)應(yīng)癌基因的DNA啟動(dòng)子局部低甲基化，抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化，異常的DNA甲基化可作為腫瘤診斷、分類和治療的重要分子標(biāo)志物[7-8]。

2.1.1 甲基化啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合體位點(diǎn) ?啟動(dòng)子中一般存在大量CpG島，這些島呈高度甲基化狀態(tài)，甲基化可改變啟動(dòng)子在基因中的原始構(gòu)型，進(jìn)而干擾特異性轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子上的特異識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者分析發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓相關(guān)基因DAZAP2啟動(dòng)子的CpG2島上存在許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合體位點(diǎn)，通過生物素5′端標(biāo)記AP-2、CREB、c-Rel非甲基化（甲基化）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)探針，提取KM3細(xì)胞核蛋白，進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲基化結(jié)合位點(diǎn)中的胞嘧啶能夠抑制某些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，DAZAP2基因的高度甲基化使得轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合大大降低，導(dǎo)致基因表達(dá)顯著下調(diào)[9]。

2.1.2 啟動(dòng)子中的甲基化序列與其特異性蛋白結(jié)合 ?啟動(dòng)子中的甲基化序列通過與細(xì)胞核內(nèi)的甲基化CG序列結(jié)合蛋白特異性結(jié)合，間接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子不能與基因結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，導(dǎo)致基因沉默或基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄終止，去甲基化則導(dǎo)致基因表達(dá)上調(diào)。白細(xì)胞介素-10（IL-10）與宮頸腫瘤的癌變呈正相關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是IL-10的重要來源細(xì)胞之一，而轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白（Sp1）可結(jié)合IL-10基因啟動(dòng)子上富含GC序列的順式作用元件，張琪[10]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化促使轉(zhuǎn)錄因子Sp1與其結(jié)合而促進(jìn)IL-10的表達(dá)。

2.2 甲基化導(dǎo)致基因點(diǎn)突變

DNA甲基化引起基因突變的機(jī)制主要是DNA序列在甲基化酶的作用下促進(jìn)C（胞嘧啶）和5mC脫氨，抑制U的修復(fù)，并且使堿基U→T改變，進(jìn)而導(dǎo)致CpG序列的C→T突變。有研究[10-11]報(bào)道發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌老年患者支氣管肺泡灌洗液內(nèi)P53基因突變導(dǎo)致患者視黃酸受體（RAR）-β基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率提高，進(jìn)而導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而正常人中的RAR-β基因的甲基化水平較低。臨床研究認(rèn)為大多單獨(dú)發(fā)生的泛發(fā)性膿皰型銀屑?。╣eneralized pustular psoriasis，GPP）是由IL36RN基因的純和或復(fù)合突變引起的，北京協(xié)和醫(yī)院的學(xué)者[12]通過研究發(fā)現(xiàn)GPP患者單核細(xì)胞全基因組DNA呈現(xiàn)異常甲基化狀態(tài)，與正常個(gè)體比較，其甲基化程度升高的位點(diǎn)5921個(gè)，甲基化程度降低的位點(diǎn)407個(gè)，GPP患者外周血單核細(xì)胞中的PDCD1基因呈高度甲基化狀態(tài)，DCD1的mRNA表達(dá)水平顯著降低，且與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步表明DNA甲基化導(dǎo)致的核苷酸序列改變可能是參與GPP發(fā)病的重要機(jī)制之一。

2.3 甲基化影響基因錯(cuò)配修復(fù)

基因突變和基因啟動(dòng)子區(qū)的高水平甲基化是導(dǎo)致在錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺陷的兩大主要原因。組蛋白的翻譯后修飾在DNA損傷信號(hào)應(yīng)答和修復(fù)中發(fā)揮了重要功能，其修飾的異常往往會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)應(yīng)答通路的阻斷和異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或基因的不穩(wěn)定性[13]。甲基化是組蛋白最常見的翻譯后修飾，H3K36甲基化（組蛋白H3第36位賴氨酸甲基化）在DNA雙鏈斷裂修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等損傷修復(fù)活動(dòng)中也發(fā)揮重要調(diào)控作用，對(duì)于賴氨酸殘基的甲基化修飾包括單甲基化、二甲基化或三甲基化修飾。Li等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，H3K36me3直接與hMSH6的PWWP結(jié)構(gòu)域結(jié)合，保證了體內(nèi)招募錯(cuò)配識(shí)別蛋白HMUTsα與染色質(zhì)的結(jié)合，在細(xì)胞周期的G1和S早期，H3K36me3的大量表達(dá)保證了hMutSα在DNA復(fù)制過程中引入錯(cuò)配修復(fù)前就富集在染色質(zhì)上，而缺失H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶SEDD2細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及自發(fā)突變頻率上升的現(xiàn)象，提示人源細(xì)胞中H3K36me3修飾調(diào)控DNA損傷修復(fù)，且與癌癥的發(fā)生緊密相關(guān)。

3 DNA甲基化與癌癥

腫瘤是一種高度異質(zhì)性的疾病，近十年來科學(xué)家們開始相信表觀遺傳學(xué)改變?cè)诎┌Y中發(fā)揮重要作用，特別是DNA甲基化。甲基化是基因組DNA在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控的一種自然修飾方式，參與基因表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過程。當(dāng)基因體內(nèi)的啟動(dòng)子出現(xiàn)甲基基團(tuán)損失而導(dǎo)致基因表達(dá)異常蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞變異并可能導(dǎo)致癌癥。

癌細(xì)胞與健康細(xì)胞在DNA甲基化的異同可以用于解釋基因的腫瘤特異性表達(dá)差異，還可以用于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物幫助檢測(cè)腫瘤、預(yù)測(cè)癌癥，預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后，為腫瘤患者制訂治療計(jì)劃，癌細(xì)胞基因甲基化研究可用于研發(fā)一些干擾癌細(xì)胞甲基化的靶向藥物來調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因甲基化模式，從而將癌細(xì)胞調(diào)整為正確的甲基化模式，抑制腫瘤生長(zhǎng)[16]。美國(guó)加州大學(xué)的張鹍教授就已創(chuàng)造高通量甲基化無創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)，他們團(tuán)隊(duì)利用癌癥標(biāo)志物和組織特異性CpG甲基化模式的雙重信號(hào)來檢測(cè)和定位癌癥，可用于癌癥的早期篩查與溯源[17]。有學(xué)者[18]認(rèn)為DNA甲基化是癌癥的起始階段，DNA甲基化水平的檢測(cè)以及這些甲基化之間的“親密程度”能判斷癌癥進(jìn)程所處階段?；蚣谆前┌Y發(fā)生發(fā)展的一種警示性標(biāo)識(shí)，對(duì)細(xì)胞的基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)、計(jì)數(shù)、繪圖等有助于醫(yī)生對(duì)癌癥進(jìn)行診斷、甄別、預(yù)防及治療，也有助于理順疾病的發(fā)病機(jī)制。

4 DNA甲基化與其他疾病

大量研究[19-20]均發(fā)現(xiàn)異常的DNA甲基化在癌癥、心血管疾病、精神疾病、自身免疫系等多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要角色。Shinagawa的研究團(tuán)隊(duì)[21]通過焦磷酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)早期認(rèn)知障礙及阿爾茨海默病患者的NCAPH2/LMF2基因啟動(dòng)子的甲基化水平上調(diào)，并認(rèn)為這種甲基化可影響神經(jīng)元細(xì)胞丟失進(jìn)而對(duì)疾病產(chǎn)生影響。寧波大學(xué)的劉桂利[22]研究發(fā)現(xiàn)OPRK1、OPRM1基因甲基化修飾與老年癡呆癥關(guān)聯(lián)，并通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在老年癡呆患者中均表現(xiàn)為高甲基化水平并且與疾病表型密切關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞因子是一種由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生的小分子多肽，具有細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、組織損傷修復(fù)、參與炎性反應(yīng)、間接殺傷癌細(xì)胞等生物學(xué)作用，DNA甲基化水平的變化可導(dǎo)致細(xì)胞因子的表達(dá)異常，進(jìn)而影響T細(xì)胞分化及反應(yīng)性發(fā)生改變。DNA低甲基化可導(dǎo)致如CD70、CD28、CD11a/CD18等細(xì)胞因子的基因表達(dá)上調(diào)，激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)B細(xì)胞分泌免疫球蛋白，引起系統(tǒng)性紅斑狼瘡的自身免疫紊亂。有學(xué)者[23]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中促進(jìn)炎癥發(fā)生的細(xì)胞因子如γ-干擾素、IL-1β、腫瘤壞死因子α、IL-17A基因的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平低于健康人群，而外周血抗炎性因子如IL-4、IL-10基因甲基化程度較正常增高，細(xì)胞因子基因上的DNA異常甲基化對(duì)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及功能有重大影響，可導(dǎo)致免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)紊亂，影響哮喘病程的發(fā)生發(fā)展。

5 展望

甲基基團(tuán)是人類基因的重要組分，DNA出錯(cuò)并甲基缺失是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的重要原因。DNA的甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，甲基化的檢測(cè)將來或可助力癌癥檢測(cè)、預(yù)測(cè)癌癥的復(fù)發(fā)等。甲基化不僅與癌癥密切相關(guān)，也與其它疾病密切相連，如人體衰老、肥胖、人體成癮性等[24-25]，DNA甲基化的模式因疾病不同而異，應(yīng)與疾病的亞型、預(yù)后及藥物反應(yīng)等臨床信息相對(duì)應(yīng)，隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，基因甲基化檢測(cè)將會(huì)成為精準(zhǔn)醫(yī)療的重要組成部分，幫助臨床醫(yī)生對(duì)患者基因進(jìn)行個(gè)體化診斷和治療。

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（收稿日期：2018-10-29 ?本文編輯：封 ? 華）