張 晶 寇 萍 秦啟萍 于 良 趙雪蓮 王希清* 楊雨春 付玉杰

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.吉林省林業(yè)科學(xué)院，長(zhǎng)春 130033)

紅松(PinuskoraiensisSieb.)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)裸子植物，常綠喬木，主要分布在中國(guó)東北部、朝鮮、日本等地區(qū)，資源非常豐富[1]。其種子含有脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，所得紅松子油可作為直接的食用油來(lái)源，其脂肪酸含量達(dá)到60%～70%，主要包括：亞麻酸、亞油酸、皮諾斂酸、棕櫚酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，具有降血脂、提高免疫力、降低體重的作用[2]。其中，皮諾斂酸(Pinolenic acid;PLA)是松子油中特有的十八碳三烯酸，其分子式為C18H30O2[3]。皮諾斂酸與其他十八碳三烯酸相比，生物活性更突出，應(yīng)用前景更廣闊。文獻(xiàn)報(bào)道皮諾斂酸能夠通過(guò)改變apo基因，從而達(dá)到降脂作用[4]。此外，皮諾斂酸具有抑制食欲的作用，通過(guò)在胃腸道里觸發(fā)近端小腸中縮膽囊素的釋放及遠(yuǎn)端小腸中的胰高血糖素樣肽-1的釋放，從而降低人的食欲[5]。

目前對(duì)脂肪酸的純化方法主要有：超臨界流體萃取法、專一性酶法、分子蒸餾法、銀離子絡(luò)合法、尿素包合法等，其中尿素包合法，因其操作簡(jiǎn)單，溶劑和尿素都可回收再利用，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性[6～7]?，F(xiàn)有利用尿素包合法純化不飽和脂肪酸的研究對(duì)象主要集中在魚(yú)油類和EPA/DHA等脂肪酸，而對(duì)皮諾斂酸純化的研究則相對(duì)較少[8～9]。通常情況下，尿素是一個(gè)四面體的結(jié)晶，當(dāng)它與游離脂肪酸化合物生成包合物后，包合物呈六面體結(jié)晶[10]。尿素包合法則主要是根據(jù)尿素與不同飽和程度脂肪酸的差異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，飽和脂肪酸易與尿素分子形成穩(wěn)定的包合物，而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被尿素包合[11～12]。因此尿素包合法可以將不同類型的脂肪酸分開(kāi)，應(yīng)用于高純度皮諾斂酸的純化制備，在植物油料的純化利用方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及現(xiàn)實(shí)意義[13]。

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，加劇了脂肪代謝紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生，如非酒精性脂肪肝、糖尿病、高血脂癥等[14～15]。非酒精性脂肪肝以肝細(xì)胞脂肪沉積為特征，與肥胖、胰島素抵抗等代謝疾病聯(lián)系密切[16～17]。因此，采用油酸(Oleic acid;OA)孵育HepG2細(xì)胞模擬體外非酒精性脂肪肝[18～20]，研究純化后的皮諾斂酸對(duì)脂質(zhì)積累的影響，為皮諾斂酸作為減肥降脂的食品提供一定理論基礎(chǔ)，為東北紅松子油的發(fā)開(kāi)及利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

紅松子油本實(shí)驗(yàn)自行提取；硫酸(98%)、尿素、90%乙醇、氫氧化鉀、色譜級(jí)正己烷，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；人肝癌細(xì)胞系(HepG2)，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；甘油三脂(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器

YP2002型分析天平；MAS-Ⅱ型微波輔助提取儀；Varian 450-GC/240-MS氣相色譜/質(zhì)譜儀；SIM細(xì)胞培養(yǎng)箱；TS-100尼康倒置用顯微鏡；DL-CJ-2N生物潔凈工作臺(tái)；Sigma 1-15K高速冷凍離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 游離脂肪酸的制備

稱取一定量的紅松子油置于三口瓶中，加入6倍體積80%乙醇溶液，再加入乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀，在65℃、500 W的微波條件下冷凝回流反應(yīng)2 h后，減壓回收乙醇至原體積的1/5，加入蒸餾水至原體積的2倍，加入石油醚萃取3次，除去不皂化物；取下層水層，用鹽酸調(diào)pH至2～3；再用正己烷萃取3次，合并正己烷層，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，水洗至中性，分離正己烷層，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓回收正己烷，制得皂化后的游離脂肪酸。

1.3.2 脂肪酸甲酯化的制備

稱取脂肪酸20 mg，加入3%硫酸—甲醇溶液1 mL，于65℃下加熱回流1 h，反應(yīng)結(jié)束后，在混合物中加入2 mL正己烷，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入適量的水分層，上層為脂肪酸甲酯，取上層液體并加入少量無(wú)水硫酸鈉除水，最后將得到的甲酯化產(chǎn)物在12 000 r·min-1的條件下離心10 min，取甲酯化產(chǎn)物以1∶2 000溶于色譜級(jí)正己烷，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3 氣相色譜分析條件

氣相條件：Agilent VF-5ms型石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm i.d×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣(99.99%)，柱內(nèi)載氣流量為2 mL·min-1；進(jìn)樣量為1.0 μL；從150℃開(kāi)始以5℃·min-1升至180℃并保留2 min，再以0.5℃·min-1升到192℃并保留1 min，再以10℃·min-1升到220℃并保留1 min；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度280℃。

1.3.4 尿素包合法純化皮諾斂酸

稱取一定量尿素和90%乙醇放入三口瓶中，加熱下不斷攪拌使尿素充分溶解，制得尿素乙醇溶液；然后將1.3.1制備的游離脂肪酸與尿素乙醇溶液混合，加熱回流50 min，冷卻至室溫，將其放置在一定溫度下冷凍結(jié)晶數(shù)小時(shí)；將尿素包合物進(jìn)行減壓抽濾，收集濾液，將乙醇旋干，再用正己烷萃取3次，合并有機(jī)相并轉(zhuǎn)移至分液漏斗，水洗至中性，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓回收正己烷后，得皮諾斂酸。為了得到更高純度的皮諾斂酸，將皮諾斂酸第二次包合，最后按照1.3.2和1.3.3進(jìn)行皮諾斂酸的甲酯化及含量檢測(cè)。

皮諾斂酸的回收率(%)=尿素包合后皮諾斂酸含量(mg)/尿素包合前皮諾斂酸含量(mg)

1.3.5 細(xì)胞的培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，并用含10%血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好且密度達(dá)到80%以上時(shí)，用胰酶消化，按1∶3比例傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 細(xì)胞存活率的測(cè)定

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。分別用0、10、20、40、80、160 μmol·L-1的皮諾斂酸培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12 h，培養(yǎng)完全后，每個(gè)孔中加入20 μL MTT(5 mg·mL-1)，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，4 h后棄培養(yǎng)液，然后加入100 μL DMSO，震蕩混勻后490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，分析皮諾斂酸對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。

1.3.7 甘油三酯及總膽固醇的測(cè)定

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。將貼壁細(xì)胞分為以下五組：空白對(duì)照組、油酸組、皮諾斂酸組(20、30、40 μmol·L-1)?？瞻讓?duì)照組及油酸組用2%培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，而皮諾斂酸組分別用20、30、40 μmol·L-1皮諾斂酸培養(yǎng)12 h，12 h后，空白對(duì)照組用2%培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，其他組用0.5 mmol·L-1油酸培養(yǎng)24 h，最后根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯及總膽固醇的水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松子油中脂肪酸成分的含量分析

通過(guò)GC-MS檢測(cè)，質(zhì)譜分析的結(jié)果與NIST05標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，確定出每個(gè)吸收峰代表的化合物，并根據(jù)峰面積計(jì)算出每個(gè)成分的相對(duì)含量。由圖1可知，松子油中含有大量的游離脂肪酸，其中包括：棕櫚酸、皮諾斂酸、亞油酸、硬脂酸、順式-9-十八碳烯酸等。通過(guò)表1可知，棕櫚酸的含量為8.06%，皮諾斂酸的含量為13.41%，亞油酸的含量為38.16%。

圖1 紅松子油脂肪酸組成GC-MS 1.棕櫚酸；2.皮諾斂酸；3. 5,9-十八碳二烯酸；4.亞油酸；5.順式-9-十八碳烯酸；6. 13-十八碳烯酸；7.硬脂酸；8. 5,11,14-二十碳三烯酸；9. 7,11,14-二十碳三烯酸；10. 11,14-二十碳二烯酸；11. 11-二十碳烯酸Fig.1 Gas chromatogram of fatty acid composition in koreanpine nut oil 1.Hexadecanoic acid; 2.Pinolenic acid; 3. 5,9-octadecadienoic acid; 4.Linoleic acid; 5.cis-9-octadecenoic acid; 6. 13-octadecenoic acid; 7.Octadecanoic acid; 8. 5,11,14-eicosatrienoicacid; 9. 7,11,14-eicosatrienoic acid; 10. 11,14-eicosadienoic acid; 11. 11-eicosenoic acid

脂肪酸Fatty acid紅松子油Korean pine seed oil(%)C16∶08.06 C18∶00.99 C18∶1(Δ9)12.34 C18∶1(Δ13)0.17 C18∶2(Δ5,9) 1.76C18∶2(Δ9,12) 38.16C18∶3(Δ5,9,12) 13.41C20∶3(Δ7,11,14)0.41C20∶1(Δ11) 0.31C20∶2(Δ11,14) 0.17C20∶3(Δ5,11,14) 0.41

圖2 脂肪酸與尿素比例對(duì)皮諾斂酸純化的影響Fig.2 Effect of ratio of fatty acid to urea on the purification of pinolenic acid

2.2 尿素包合法純化參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 脂肪酸與尿素的比例對(duì)皮諾斂酸純化的影響

在尿素和90%乙醇比例為1∶6，包合溫度為4℃，包合時(shí)間為24 h時(shí)，在這些條件下，考慮脂肪酸與尿素的比例(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶6.5、1∶7)對(duì)皮諾斂酸純化的影響。由圖2可知隨著脂肪酸與尿素比例的增加，皮諾斂酸的含量先增加后降低，原因可能是隨著尿素的增加，包合效果更顯著，皮諾斂酸含量增加，而尿素過(guò)量時(shí)，會(huì)阻礙包合晶體生長(zhǎng)，導(dǎo)致皮諾斂酸收率降低。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量為37.96%時(shí)，回收率為36%，確定脂肪酸：尿素的最佳比例為1∶6.5。

2.2.2 尿素與乙醇的比例對(duì)皮諾斂酸純化的影響

在脂肪酸與尿素之比為1∶6.5，包合溫度為4℃，包合時(shí)間為24 h時(shí)，在這些條件下，考慮尿素與90%乙醇比例(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)對(duì)皮諾斂酸純化效果的影響。乙醇含量的增加，導(dǎo)致尿素溶解量升高，具有促進(jìn)包合的作用；而過(guò)量的乙醇則導(dǎo)致部分脂肪酸溶于乙醇中，使皮諾斂酸含量降低。由圖3可知，隨著乙醇的增加，皮諾斂酸收率呈波動(dòng)性變化。因此，綜合皮諾斂酸含量為45.3%時(shí)，回收率為42%，確定尿素：乙醇的最佳比例為1∶4。

圖3 尿素與乙醇比例對(duì)皮諾斂酸純化的影響Fig.3 Effect of ratio of urea to ethanol on the purification of pinolenic acid

2.2.3 包合溫度對(duì)皮諾斂酸純化的影響

圖4 尿素包合溫度對(duì)皮諾斂酸純化的影響Fig.4 Effect of urea inclusion temperature on the purification of pinocyanoic acid

圖5 尿素包合時(shí)間對(duì)皮諾斂酸純化的影響Fig.5 The effect of urea inclusion time on the purification of pinocyanoic acid

圖6 一次尿素包合后皮諾斂酸GC-MS圖Fig.6 Meteorological chromatogram of pinolenic acid after a urea inclusion

在脂肪酸與尿素之比為1∶6.5，尿素與乙醇為1∶4，包合時(shí)間為24 h時(shí)，在這些條件下，考慮包合溫度(4、0、-10、-20℃)對(duì)皮諾斂酸提純化效果的影響。包合溫度較低時(shí)，形成的包合結(jié)晶物較快，但脂肪酸包合不牢固，從而使皮諾斂酸含量降低。而溫度升高時(shí)，溶劑與包合物易同時(shí)凝固，導(dǎo)致抽濾難度增大，降低皮諾斂酸的收率。因此，綜合皮諾斂酸含量為54%時(shí)，回收率為48.8%，確定最佳的包合溫度為-10℃(圖4)。

圖7 二次尿素包合后皮諾斂酸GC-MS圖Fig.7 Meteorological chromatogram of pinolenic acid after secondary urea inclusion

2.2.4 包合時(shí)間對(duì)皮諾斂酸純化的影響

在脂肪酸與尿素之比為1∶6.5，尿素與乙醇為1∶4，包合溫度為-10℃時(shí)，在這些條件下，考慮包合時(shí)間(6、12、24、36 h)對(duì)皮諾斂酸純化效果的影響。隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，包合結(jié)晶物會(huì)增加，包合效果顯著。但隨著包合時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，包合晶體逐漸增多，對(duì)皮諾斂酸的攜帶和吸附也增多，導(dǎo)致了皮諾斂酸含量的降低。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量為58.3%時(shí)，回收率為51.8%，確定最佳的包合時(shí)間為12 h(圖5)。

2.2.5 純化產(chǎn)物皮諾斂酸的GC-MS圖

采用脂肪酸與尿素之比為1∶6.5，尿素與乙醇之比為1∶4，包合溫度為-10℃，包合時(shí)間為12 h時(shí)，獲得如圖6所示的GC-MS圖，質(zhì)譜分析的結(jié)果與NIST05標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，皮諾斂酸的含量達(dá)到58.3%，回收率為51.8%。為了獲得更高純度的皮諾斂酸，進(jìn)行二次尿素包合，經(jīng)GC-MS檢測(cè)皮諾斂酸純度為72.5%，回收率為64.7%(圖7)。

圖8 皮諾斂酸對(duì)細(xì)胞生存率的影響Fig.8 Effects of pinolenic acid on cell viability

圖9 皮諾斂酸對(duì)甘油三酯水平的影響Fig.9 The effect of pinolenic acid on triglyceride level

圖10 皮諾斂酸對(duì)總膽固醇水平的影響Fig.10 The effect of pinolenic acid on total cholesterol level

2.3 皮諾斂酸對(duì)細(xì)胞活力的影響

由圖8可知，隨皮諾斂酸濃度的升高，細(xì)胞的活力逐漸降低，并且當(dāng)皮諾斂酸濃度高于80 μM時(shí)，細(xì)胞的存活率僅80%左右，而當(dāng)皮諾斂酸濃度低于40 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞的生存率均在90%左右，因此選擇40 μmol·L-1濃度以下的皮諾斂酸用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

2.4 皮諾斂酸對(duì)甘油三酯及總膽固醇水平的影響

由圖9可知，油酸組中甘油三酯的含量是空白對(duì)照組的二倍，說(shuō)明油酸成功的誘導(dǎo)細(xì)胞成脂。然而隨著皮諾斂酸濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平逐漸的降低，并在皮諾斂酸濃度為40 μmol·L-1時(shí)，其降脂效果最佳，降低了模型中1/3的甘油三酯。由圖10可知，油酸組中總膽固醇的水平是空白對(duì)照組的二倍多，而加入皮諾斂酸后，細(xì)胞中總膽固醇水平呈劑量依賴性的降低，并在40 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最佳的效果。

3 討論

皮諾斂酸是松子油中獨(dú)有的十八碳三烯酸，表現(xiàn)出多種對(duì)人體有益的生物活性，如降低體重、降血脂、抗氧化等，因此，采用一種高效環(huán)保的富集方法用于純化皮諾斂酸是非常有必要的。本研究以紅松子油為原料，優(yōu)化了尿素包合法中脂肪酸與尿素的比例、尿素與90%乙醇的比例、包合溫度、包合時(shí)間等參數(shù)。研究表明，隨著脂肪酸與尿素比例的增加，包合效果更加顯著，然而隨著尿素含量量的過(guò)度增加，使得晶體在包合其他脂肪酸的同時(shí)，對(duì)皮諾斂酸的攜帶和吸附也有所增加，導(dǎo)致皮諾斂酸收率降低[6]。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量及收率，脂肪酸與尿素的最佳比例為1∶6.5(w/w)；隨著乙醇含量增加，尿素的溶解量逐漸增加，包合向正反應(yīng)方向進(jìn)行，而過(guò)量的乙醇會(huì)導(dǎo)致尿素比例減少，部分脂肪酸溶于乙醇中，使皮諾斂酸含量降低，而且隨著乙醇含量的增加，皮諾斂酸收率率呈波動(dòng)性變化[8]。因此，綜合皮諾斂酸含量和收率的考慮，尿素與90%乙醇的最佳比例為1∶4(w/v)；包合溫度較低時(shí)，包合效果向正方向進(jìn)行，而溫度升高時(shí)，溶劑與包合物粘連很難分開(kāi)，導(dǎo)致收率降低[10]。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量及收率，確定最佳的包合溫度為-10℃；隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，包合效果向正方向進(jìn)行，而當(dāng)包合時(shí)間為12 h時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡，隨著包合時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致皮諾斂酸的攜帶增加，含量降低，回收率降低[12]。因此，綜合考慮皮諾斂酸含量及收率，確定最佳的包合時(shí)間為12 h。在上述條件下，經(jīng)GC-MS檢測(cè)獲得了純度為58.3%的皮諾斂酸，回收率為51.8%，經(jīng)二次尿素包合純化后可獲得純度為72.5%的皮諾斂酸，回收率為64.7%。

此外，運(yùn)用油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞成脂，進(jìn)一步評(píng)估所制備皮諾斂酸的降脂活性。雖然許多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者采用動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，然而動(dòng)物模型周期長(zhǎng)，個(gè)體差異大，影響因素較多等缺點(diǎn)，因此本文采用細(xì)胞模型，同樣能較好的模擬脂質(zhì)積累的重要特征[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40 μmol·L-1的皮諾斂酸降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯及總膽固醇水平最佳，說(shuō)明皮諾斂酸具有一定的降脂作用。

綜上所述，利用尿素包合法純化皮諾斂酸，具有操作簡(jiǎn)單，成本低，溶劑和尿素都可回收，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。此外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了40 μmol·L-1皮諾斂酸具有顯著的降脂活性。因此，本研究為東北地區(qū)紅松子油產(chǎn)品的深加工及高附加值開(kāi)發(fā)利用提供了一定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為皮諾斂酸作為降脂減肥食品提供了新思路。