木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕制備抗氧化多肽的研究

王攀 范娜

摘要：以核桃餅粕為原料，研究?jī)?yōu)化木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕制備抗氧化活性多肽的工藝條件。通過(guò)研究酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響，正交優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并將酶解物利用葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行分離，測(cè)定其抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)木瓜蛋白酶在酶解溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為 3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 mL、加酶量為6 500 U/g、pH值為6.5的酶解條件下，酶解物的抗氧化活性較好，酶解液對(duì)二苯代苦味?；杂苫―PPH·）和羥基自由基的清除率分別為52.24%和53.20%;酶解液經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱分離，酶解物分離多肽的分子量越大，抗氧化活性越低。

關(guān)鍵詞：核桃餅粕;木瓜蛋白酶;抗氧化活性;生物活性肽

中圖分類號(hào)： TS209? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0238-04

收稿日期：2018-03-09

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2016NY-147）;商洛學(xué)院服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展專項(xiàng)（編號(hào)：2015SKY-FWDF004）。

作者簡(jiǎn)介：王 攀（1983—），男，陜西寶雞人，碩士，講師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品綜合利用及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。Tel：（0914）2398182;E-mail：w1p2004@163.com。? 核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有豐富的油脂和蛋白質(zhì)，在工業(yè)生產(chǎn)中常被作為榨油用料[1]，核桃餅粕是核桃油深加工的副產(chǎn)物[2]，大多作為動(dòng)物飼料，目前對(duì)其利用具有一定的局限性，主要集中于蛋白質(zhì)與多肽的開(kāi)發(fā)方面[3]。雖然核桃餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%～50%[4]，但核桃蛋白溶解性較低[5]，限制了食品加工中核桃蛋白的利用[6]。近年來(lái)，對(duì)核桃餅粕的深加工已逐步開(kāi)展起來(lái)，主要是利用核桃餅粕制備核桃多肽[7]，核桃多肽不僅具有良好的溶解性，而且還具有易消化吸收、促進(jìn)微生物發(fā)酵以及抗氧化等生理活性[6]?？寡趸氖且环N具有抗氧化活性的生物活性肽，具有清除體內(nèi)自由基的功能，是一種潛在的、可以利用的外源性抗氧化物質(zhì)[8]，且采用酶水解核桃蛋白可以制得具有抗氧化活性的生物活性肽[9]。本研究主要以核桃餅粕為原料，通過(guò)研究酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值等因素對(duì)木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕產(chǎn)物抗氧化活性的影響，正交優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并對(duì)酶解物利用葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行分離，考察分離物的抗氧化活性，以期為核桃餅粕抗氧化活性多肽的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 核桃餅粕，購(gòu)自洛南食品加工廠;木瓜蛋白酶（酶活性100 000 U/g），購(gòu)自南寧宏博生物工程有限公司;DPPH，購(gòu)自Sigma公司;無(wú)水乙醇、乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、H2O2溶液、鄰二氮菲均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備 FA1004型電子分析天平，購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;755B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL-40B型低速臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自北京科偉永興儀器有限公司;UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海美析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃蛋白的制備 將10 g核桃餅粕溶解在100 mL磷酸緩沖液（pH值為7.5～10.0）中，調(diào)節(jié)溫度至60 ℃，并用NaOH溶液（3.5 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至8.5～9.0，在溶解過(guò)程中不斷攪拌1 h，冷卻后，4 000 r/min離心20 min，取上清液，用HCl（1 mol/L）將pH值調(diào)至4.0～5.0，靜置30 min，4 000 r/min 離心20 min，取沉淀低溫干燥或風(fēng)干，得核桃蛋白，備用[10]。

1.2.2 核桃多肽液的制備 取3 g核桃蛋白溶于100 mL水中，在60 ℃水浴鍋中保溫30 min，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至6.5，并維持pH值和溫度恒定，加入7 000 U/g木瓜蛋白酶，酶解4 h后，沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻后，4 000 r/min 離心15 min，取上清液備用[11]。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 利用木瓜蛋白酶按照“1.2.2”節(jié)的方法酶解核桃餅粕，并固定其他條件，分別單一改變其中酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、底物濃度（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/100 mL）、酶添加量（6 000、6 500、7 000、7 500、8 000 U/g）、酶解時(shí)間（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），獲得酶解液，考察核桃餅粕酶解物的抗氧化活性。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素的基礎(chǔ)之上，選擇4個(gè)影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白制備抗氧化多肽的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 清除二苯代苦味?；杂苫―PPH·）能力的測(cè)定配制0.02 mol/L DPPH溶液，取2 mL置于試管中，加入 2 mL 無(wú)水乙醇搖勻，避光靜置30 min，用無(wú)水乙醇作參比，在517 nm下測(cè)定吸光度，記為D1;另將2 mL酶解液與2 mL 0.02 mol/L DPPH溶液充分混合，避光靜置30 min，并以2 mL酶解液與 2 mL 無(wú)水乙醇混合作為參比測(cè)定其吸光度，記為D2[12-14]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=D1-D2D1×100%。

1.3.2 清除羥基自由基（·OH）能力的測(cè)定 采用鄰二氮 菲-Fe2+ 氧化法[12-15]測(cè)定核桃餅粕酶解物清除羥基自由基的能力。（1）吸取15 mmol鄰二氮菲應(yīng)用液 1 mL 放于試管中，先加入pH值為7.5的磷酸緩沖液2 mL以及1 mL的蒸餾水，充分振蕩后加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，立刻混勻，最后加入1% H2O2溶液1 mL，室溫下靜置 1 h。在波長(zhǎng)為536 nm處測(cè)定吸光度，記為Db;（2）同上，用1 mL蒸餾水代替（1）中的H2O2溶液，在波長(zhǎng)為536 nm處測(cè)定吸光度，記為Dc;（3）用1 mL酶解液代替（1）中的蒸餾水，在波長(zhǎng)為536 nm處測(cè)定吸光度，記為Da;羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=Da-DbDc-Db×100%。

1.3.3 Sephadex G-50層析分離核桃蛋白 層析條件如下：層析柱中凝膠為葡聚糖凝膠G-50;柱床體積為1.6 cm×60.0 cm;上樣量為2 mL;流速為0.16 mL/min;緩沖液為去離子水;柱溫為室溫（25 ℃左右）。

用去離子水調(diào)節(jié)流速，沖洗凝膠柱，待柱平衡后，取正交試驗(yàn)最優(yōu)酶解條件下所得的核桃餅粕蛋白多肽液2 mL進(jìn)行上樣，每小時(shí)收集1管，測(cè)定其抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶解溫度對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖1可知，木瓜蛋白酶酶解溫度對(duì)核桃餅粕酶解物的抗氧化活性有一定的影響。隨酶解溫度的升高，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達(dá)到最高，但隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，抗氧化活性逐漸降低，這主要是由隨溫度的繼續(xù)升高，木瓜蛋白酶的活性在高溫下逐漸降低所致。

2.1.2 底物濃度對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖2可知，木瓜蛋白酶酶解底物濃度對(duì)核桃餅粕酶解物的抗氧化活性有一定的影響。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.0～2.5 g/100 mL時(shí)，隨底物濃度的增加，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.5 g/100 mL時(shí)，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達(dá)到最高，但隨底物濃度的進(jìn)一步增大，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性基本穩(wěn)定。

2.1.3 酶添加量對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖3可知，木瓜蛋白酶添加量對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性有明顯的影響，隨酶添加量的增大，核桃餅粕酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且核桃餅粕酶解物對(duì)DPPH自由基清除率明顯低于羥基自由基。當(dāng)酶添加量為7 000 U/g時(shí)，DPPH自由基和羥基自由基清除率都達(dá)到最高，但當(dāng)酶添加量在6 500～7 000 U/g范圍內(nèi)時(shí)，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性變化不大。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖4可知，木瓜蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性有一定的影響。當(dāng)酶解時(shí)間為3.0～4.0 h時(shí)，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性變化較小;當(dāng)酶解時(shí)間大于4.0 h時(shí)，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì);酶解3.5 h時(shí)，核桃餅粕酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除率都達(dá)到最高，分別為46.73%、47.28%。

2.1.5 酶解pH值對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性的影響 由圖5可知，木瓜蛋白酶酶解pH值對(duì)核桃餅粕酶解物抗氧化活性有明顯的影響。隨著酶解pH值的升高，核桃餅粕酶解物的抗氧化活性先升高后降低;當(dāng)酶解pH值為6.5時(shí)，核桃餅粕酶解物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除率都達(dá)到最高，分別為45.64%、46.16%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解溫度、底物濃度、酶添加量（加酶量）、酶解pH值4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解制備核桃抗氧化多肽工藝條件。

由表2可知，4種因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響大小依次為溫度>加酶量>pH值>底物濃度，對(duì)羥基自由基清除率的影響大小依次為溫度>底物濃度>pH值>加酶量。且最佳水平組合均為A2B2C1D2，即酶解溫度60 ℃、底物濃度2.5 g/100 mL、酶添加量6 500 U/g、酶解pH值6.5，在上述條件下，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)DPPH自由基清除率達(dá)到52.24%，羥基自由基清除率達(dá)到53.20%。

2.3 葡聚糖凝膠層析

按照“1.3.3”節(jié)的方法將酶解液過(guò)葡聚糖凝膠層析柱，按時(shí)間順序，每小時(shí)收集1管，共收集7管，并按收集時(shí)間進(jìn)行編號(hào)，測(cè)每管洗脫液的抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，不同分離物之間抗氧化性存在明顯差異，且當(dāng)洗脫時(shí)間小于1 h或大于6 h時(shí)，其分離物無(wú)抗氧化活性;當(dāng)洗脫時(shí)間為2～6 h時(shí)，隨洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，分離物的抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，洗脫時(shí)間為6 h時(shí)，分離物的抗氧化活性最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除率分別為42.38%和44.49%。根據(jù)凝膠層析分離原理，分子量大的物質(zhì)先流出凝膠柱，分子量小的物質(zhì)后流出凝膠柱[16-17]，由此可知，2～6管分離物的分子量依次降低，說(shuō)明分離物的抗氧化活性隨分子量的減小逐漸增強(qiáng)。

4 結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕時(shí)，酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、酶添加量以及酶解pH值對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性均有一定的影響，且當(dāng)木瓜蛋白酶在酶解溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 mL、加酶量為6 500 U/g、pH值為6.5的酶解條件下，酶解物的抗氧化活性較好，酶解液對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為52.24%和53.20%。

木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕，其酶解所得多肽液的抗氧化活性隨分子量的增大逐漸降低。

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