陳麗梅，劉利華，胡宏輝，秦藝銘，周文禮，孫敬鋒，郭永軍

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

毛蚶(Scapharcasubcrenata)屬雙殼綱、蚶目、蚶科、毛蚶屬，廣泛分布于中國、日本、朝鮮、韓國沿岸，在中國以遼東灣、渤海灣、萊州灣和海州灣資源尤為豐富；毛蚶的棲息環(huán)境主要是在淺海和稍有淡水流入的內(nèi)灣，在潮間帶和潮下帶也有一定數(shù)量的分布[1]。毛蚶采捕業(yè)一直是天津的傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，在20世紀(jì)70年代中期，毛蚶產(chǎn)量一度超過淡水魚等水產(chǎn)品，占水產(chǎn)品總量的35.95%，居天津市水產(chǎn)品產(chǎn)量首位[2]。近年來，為了對毛蚶自然資源進(jìn)行有效補(bǔ)充，天津地區(qū)的毛蚶池塘養(yǎng)殖規(guī)模也在逐漸擴(kuò)大，而季節(jié)變化和降雨常常引起池塘溫度的劇烈波動(dòng)，對其生長和存活造成不利影響。因此，研究溫度變化對毛蚶的影響具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。目前相關(guān)研究主要集中在溫度對毛蚶生長、存活和代謝等方面的影響上，如楊玉香等[3]研究發(fā)現(xiàn)，毛蚶幼貝的最適生長水溫為20～26 ℃；楊鳳等[4]曾報(bào)道，在10、15、20、25、30 ℃溫度條件下，毛蚶在10 h內(nèi)排遺速率以20 ℃最高，30 ℃下4 h內(nèi)全部死亡；姜祖輝等[5]研究了11、14、17 ℃條件下毛蚶耗氧率和排氨率的變化，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，毛蚶的耗氧率和排氨率均逐漸增大。而關(guān)于溫度對毛蚶抗氧化酶的影響尚未見報(bào)道。

溫度是影響貝類生命活動(dòng)的重要環(huán)境因子之一。溫度變化會使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，長期處于應(yīng)激狀態(tài)會導(dǎo)致機(jī)體自由基代謝紊亂、免疫防御能力下降[6]，當(dāng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)不足以清除體內(nèi)過多自由基時(shí)，就會對機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[7]。貝類和魚類等其他水生動(dòng)物抗氧化酶系統(tǒng)作用類似，其中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等酶類，在清除過量活性氧、緩解自身損害方面發(fā)揮著重要的作用[8]。筆者探討了毛蚶鰓、外套膜和肝胰腺組織中抗氧化酶活性在溫度突變條件下的變化情況，旨在為毛蚶的溫度響應(yīng)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為毛蚶的養(yǎng)殖與管理提供更完善的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用毛蚶采自天津漢沽大神堂海域，殼長(35.16±4.58) mm，體質(zhì)量(13.49±5.73) g。暫養(yǎng)期間海水溫度為(11±1) ℃，鹽度為(28±0.5)，連續(xù)充氣，日換水1次，換水量為50%，投喂球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)。暫養(yǎng)7 d后，選擇健康、活性強(qiáng)、規(guī)格基本一致的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)溫度組：11(對照組)、14、17、20、23 ℃，每個(gè)溫度組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行40枚毛蚶，試驗(yàn)在36 cm×21 cm×11 cm的塑料槽中進(jìn)行，試驗(yàn)開始后，將毛蚶由11 ℃直接轉(zhuǎn)移至各溫度組，在0、3、6、12、24、48、96 h進(jìn)行取樣，每個(gè)平行組隨機(jī)取3枚毛蚶。

1.3 樣品處理與酶活性測定

解剖毛蚶，取其鰓、外套膜和肝胰腺組織用0.9%生理鹽水清洗，液氮速凍后于-80 ℃保存，待樣品全部采集完成后統(tǒng)一測定。測定時(shí)加入9倍于其組織質(zhì)量的生理鹽水，冰水浴中研磨制備組織勻漿。所得的組織勻漿于4 ℃、3000 r/min離心10 min后，取上清液用生理鹽水按1∶9比例稀釋用于蛋白定量和抗氧化酶活性的測定。酶活性的測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，通過單因素方差分析和Duncan多重比較法來分析不同處理組間酶活性的差異，以P<0.05表示差異顯著，并使用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度突變對毛蚶存活率的影響

整個(gè)試驗(yàn)期間，對照組(11 ℃)和14 ℃溫度組毛蚶的存活率均為100%；17 ℃溫度組毛蚶在第48 h開始出現(xiàn)死亡，隨著溫度的升高，毛蚶死亡率逐漸增加；20 ℃溫度組毛蚶48 h存活率為75%；23 ℃溫度組毛蚶48 h存活率降至50%，并于96 h時(shí)全部死亡；25 ℃溫度組12 h內(nèi)毛蚶全部死亡(表1)。

2.2 溫度突變對毛蚶鰓組織抗氧化酶活性的影響

溫度突變對毛蚶鰓組織超氧化物歧化酶的影響見圖1a。對照組(11 ℃)鰓組織的超氧化物歧化酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

溫度突變對毛蚶鰓組織過氧化氫酶的影響見圖1b。對照組(11 ℃)鰓組織的過氧化氫酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，于3、6 h顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，于3 h顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，于3 h顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，于3 h顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

溫度突變對毛蚶鰓組織谷胱甘肽過氧化物酶的影響見圖1c。對照組(11 ℃)鰓組織的谷胱甘肽過氧化物酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

2.3 溫度突變對毛蚶外套膜組織抗氧化酶活性的影響

溫度突變對毛蚶外套膜組織超氧化物歧化酶的影響見圖2a。對照組(11 ℃)外套膜組織的超氧化物歧化酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

圖1 不同溫度對毛蚶鰓組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響不同小寫字母表示同一取樣時(shí)間點(diǎn)間各數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)；*表示不同時(shí)間點(diǎn)和0 h數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05).下同.

溫度突變對毛蚶外套膜組織過氧化氫酶的影響見圖2b。對照組(11 ℃)外套膜組織的過氧化氫酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在24 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在24 h后恢復(fù)至初始水平。

溫度突變對毛蚶外套膜組織谷胱甘肽過氧化物酶的影響見圖2c。對照組(11 ℃)外套膜組織的谷胱甘肽過氧化物酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

圖2 不同溫度對毛蚶外套膜組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

2.4 溫度突變對毛蚶肝胰腺組織抗氧化酶活性的影響

溫度突變對毛蚶肝胰腺組織超氧化物歧化酶的影響見圖3a。對照組(11 ℃)外套膜組織的超氧化物歧化酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降趨勢，3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

溫度突變對毛蚶肝胰腺組織過氧化氫酶的影響見圖3b。對照組(11 ℃)肝胰腺組織的過氧化氫酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在3 h時(shí)到達(dá)峰值，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

圖3 不同溫度對毛蚶肝胰腺組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

溫度突變對毛蚶肝胰腺組織谷胱甘肽過氧化物酶的影響見圖3c。對照組(11 ℃)肝胰腺組織的谷胱甘肽過氧化物酶活性在試驗(yàn)期間基本保持穩(wěn)定；14 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降趨勢，在3、6 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，并且在6 h時(shí)到達(dá)峰值，在24 h后恢復(fù)至初始水平；17 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；20 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降的趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平；23 ℃溫度組中谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降趨勢，在3 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h后恢復(fù)至初始水平。

3 討 論

3.1 溫度突變對毛蚶生存的影響

貝類是變溫動(dòng)物，溫度是影響其新陳代謝的重要因子之一，溫度升高能夠加強(qiáng)生物體內(nèi)的代謝，但超過一定范圍會抑制其生長，甚至造成死亡。毛蚶生長的適應(yīng)溫度為18～28 ℃[1]，低于或高于這個(gè)范圍其生長會受到影響。本研究中，11、14 ℃和17 ℃溫度組毛蚶生存狀況良好，20 ℃和23 ℃溫度組毛蚶在48 h開始出現(xiàn)死亡，超過25 ℃的溫度組中毛蚶12 h內(nèi)全部死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度升高幅度越大，對毛蚶存活率的影響越明顯，且死亡率隨脅迫時(shí)間的延長不斷上升。陳雷等[9]采用緩慢升溫的方式(每日升溫1～2 ℃)研究了溫度對遼寧沿海毛蚶潛沙能力的影響，亦發(fā)現(xiàn)毛蚶在溫度升至25 ℃時(shí)，12 h后未潛沙個(gè)體的生命活力已經(jīng)開始明顯降低。本研究和陳雷等[9]的研究均發(fā)現(xiàn)，毛蚶在未達(dá)到其生存的極限溫度28 ℃時(shí)，已經(jīng)開始表現(xiàn)出生命活力降低甚至死亡的現(xiàn)象。其原因是兩個(gè)毛蚶采集地點(diǎn)均為北方海域，海水溫度常年較低，與南方毛蚶種群在高溫耐受性上存在一定的差異，導(dǎo)致毛蚶的生存極限溫度不同[9]。此外，本研究采取溫度驟升的方式，對毛蚶機(jī)體的影響更為劇烈，存活率較之其他升溫方式更低。

3.2 溫度突變對毛蚶抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶都是生物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。超氧化物歧化酶可以將體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫酶再將過氧化氫還原成水分子和氧分子，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的變化可以準(zhǔn)確的反映機(jī)體內(nèi)自由基的代謝情況，谷胱甘肽過氧化物酶以谷胱甘肽為底物清除過氧化氫，功能與過氧化氫酶類似，同時(shí)還可以清除脂質(zhì)過氧化物。3種酶對判斷機(jī)體的健康狀況及抗氧化防御能力具有重要意義[10-11]。

不同溫度組的試驗(yàn)結(jié)果表明，在高溫脅迫3 h后，毛蚶3種組織中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均在17 ℃時(shí)達(dá)到最大值，過氧化氫酶活性在鰓、外套膜和肝胰腺中分別在14、17 ℃和20 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后下降。整體來看，3種抗氧化酶活性隨溫度升高基本呈先升后降的趨勢。劉峰等[12]對小黃魚(Pseudosciaenapolyactis)進(jìn)行29、31、32 ℃和33 ℃ 4個(gè)溫度梯度處理后，肝臟和腸道內(nèi)抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)活性的變化也呈先升后降的趨勢，31 ℃時(shí)其酶活性最大。錢佳慧等[13]研究了華貴類櫛孔扇貝(Mimachlamysnobilis)在19～31 ℃時(shí)抗氧化酶的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均呈先升后降的趨勢，分別在25、26、26 ℃達(dá)到峰值。試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母邷乜梢鹂寡趸富钚栽黾樱鸬奖Ｗo(hù)作用，但過度的高溫亦可引起機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致抗氧化酶活性下降[12]。

另外，各溫度組毛蚶在溫度驟升后，鰓、外套膜和肝胰腺中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性隨時(shí)間增加均呈升高的趨勢，并于3 h和6 h達(dá)到峰值，24 h后基本恢復(fù)為對照組水平。說明毛蚶在受到高溫脅迫后，在3～6 h內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，抗氧化酶活性在短時(shí)間內(nèi)迅速上升以清除產(chǎn)生的自由基，機(jī)體適應(yīng)環(huán)境后，毛蚶體內(nèi)自由基達(dá)到平衡狀態(tài)，抗氧化酶活性恢復(fù)至正常水平。在一定程度上，抗氧化酶恢復(fù)至正常水平的時(shí)間反映了機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)能力[14]。李曉英等[15]的研究也表明，在對青蛤(Cyclinasinensis)進(jìn)行32 ℃的高溫脅迫后，肝胰腺中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均顯著升高，于3 h達(dá)到最大值，并分別在7 h和5 h后逐漸恢復(fù)至起始水平，與本研究結(jié)果類似。而在對青蛤的另外一種抗氧化酶——過氧化物酶的研究中發(fā)現(xiàn)，其活性在溫度驟升5 h后達(dá)到最高值，之后下降，于11 h又出現(xiàn)第二峰值[16]。過氧化物酶與過氧化氫酶一樣存在于過氧化酶酶體中，可催化過氧化氫水解，同時(shí)也可分解胺、醇、酚等細(xì)胞有害物質(zhì)[17]，說明不同酶或不同物種對于溫度的響應(yīng)還存在一定差異。

3.3 毛蚶3種組織抗氧化酶活性的比較

雙殼貝類的肝胰腺作為消化器官，內(nèi)有大量的酶類[16]，是研究環(huán)境脅迫下抗氧化酶活性變化的重要代表性器官；而鰓作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透調(diào)節(jié)的重要組織器官，在鹽度和pH脅迫的研究中涉及較多[18-19]，在溫度脅迫的研究中也具有一定的代表性[20]。貝類的外套膜作為病原及異物入侵軟體部的第一道屏障，會分泌出一種硫酸性黏液物質(zhì)，對病原菌和入侵異物具有抑制和殺害的作用，在貝類的防護(hù)免疫過程中也發(fā)揮著重要作用[21]。本研究選擇毛蚶的肝胰腺、鰓和外套膜3種組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在毛蚶各組織中，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性為肝胰腺>外套膜>鰓。李曉英等[16]在對青蛤另一種抗氧化酶——過氧化物酶的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度驟升前后各組織過氧化物酶的活性均為肝胰腺的活力最高，其次為鰓和外套膜，與本研究結(jié)果有一定的相似性。而吳靜[22]在華貴類櫛孔扇貝低溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，華貴類櫛孔扇貝幼貝和成貝外套膜中超氧化物歧化酶活力顯著高于鰓、肝胰腺和閉殼??；外套膜和鰓中過氧化氫酶活力顯著高于閉殼肌和肝胰腺。本研究結(jié)果表明，肝胰腺是最能代表毛蚶機(jī)體抗氧化防御變化的器官，和在小黃魚[12]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[23]等魚類中的結(jié)論一致。鰓、肝胰腺和外套膜中的抗氧化酶活性在不同貝類中存在差異，有待于進(jìn)一步研究。