白 云，王 妍，胡 瑩，張興華，金萬昆，高永平，楊建新，董 仕

( 1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；2.國家級天津市換新水產(chǎn)良種場，天津 301500 )

鯉魚(Cyprinuscarpio)是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類。我國的鯉魚可分為4個亞種：西鯉(C.carpiocarpio)，分布于我國的新疆以及歐洲；鯉(C.carpiohaematopterus)，分布于北到黑龍江，南到長江、閩江以及臺灣；華南鯉(C.carpiorubrofuscus)，也叫海鯉、元江鯉、團鯉，分布于西江、云南元江以及海南島；杞麓鯉(C.carpiochilia)，分布于云南湖泊中[1]。自20世紀70年代開始，我國開展了多方面的鯉魚遺傳育種研究工作，培育出很多新品種用于養(yǎng)殖生產(chǎn)或作為雜交用親本，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益。如興國紅鯉(C.carpiosinguonensis)、荷包紅鯉(C.carpiowuyuanensis)、豐鯉(C.carpiosinguonensis♀×C.carpiovar.mirrorsplittered♂)、建鯉(C.carpiovar.jian)、德國鏡鯉(C.carpioL mirror)、散鱗鏡鯉(C.carpio)、烏克蘭鱗鯉(C.carpio)、津新鯉(C.carpiojinxin)等[2]。

線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，為共價閉合的環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，具有分子量小、遵循母性遺傳、進化速度快等特點，成為研究群體間親緣關(guān)系的重要遺傳標記，線粒體DNA的D-loop區(qū)段也稱控制區(qū)，具有高突變、進化快等特點，是近年來線粒體DNA的研究熱點[3-7]。鄭文娟等[8]對舟山小黃魚(Pseudosciaenapolyactis)進行了線粒體DNA D-loop區(qū)段序列變異的遺傳多樣性分析，袁振興等[9]對都柳江鯉魚、鯽魚(Carassiusauratus)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)線粒體DNA的控制區(qū)進行了遺傳多樣性分析，董新培等[10]對不同地理群體烏鱧(Channaargus)進行了線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析。

烏克蘭鱗鯉于1998年由天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站通過農(nóng)業(yè)部引種中心引進，2002年天津市技術(shù)推廣站將親本轉(zhuǎn)至天津市換新水產(chǎn)良種場，2005年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定[11]。德國鏡鯉原產(chǎn)于德國巴伐利亞，由農(nóng)業(yè)部于1984年自德國引進[12-14]?？蝼[鏡鯉(C.carpiovar.specularis)簡稱框鯉，由德國鏡鯉經(jīng)選育而來[15-16]。紅鏡鯉(C.carpioL mirror)是國家級天津市換新水產(chǎn)良種場在德國鏡鯉中發(fā)現(xiàn)的紅色個體。州河鯉(C.carpioheamatopterus)是天津市薊州區(qū)于橋水庫中的一種地方野鯉[17-19]。本研究以烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉、紅鏡鯉和州河鯉為材料，進行了線粒體DNA D-loop區(qū)段的遺傳多樣性檢測分析，以期為鯉魚的遺傳育種提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

5種類型鯉魚的采樣時間、地點、樣本含量以及體長、體質(zhì)量見表1，其中德國鏡鯉和紅鏡鯉剪取鰭條作為研究材料。

表1 5種類型鯉魚的采樣時間、地點、樣本含量及體長、體質(zhì)量

注：*，德國鏡鯉及紅鏡鯉采集了鰭條.

1.2 總DNA的提取

剪取約1.0 cm×0.5 cm的鰭條，采用苯酚—氯仿抽提法提取總DNA，4 ℃保存?zhèn)溆肹20]。

1.3 線粒體DNA D-loop及其鄰近區(qū)段的擴增

使用位于線粒體DNA D-loop區(qū)段兩側(cè)的引物進行PCR擴增，引物序列為，L15923： 5′-TTA AAG CAT CGG TCT TGT AA-3′[21]，H1067： 5′-ATA GTG GGG TAT CTA ATC CCA GTT-3′[22]，結(jié)合位點分別位于tRNAPro和12S rRNA兩個編碼區(qū)上，PCR反應(yīng)體系參照文獻[23]的方法。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，委托華大基因公司進行測序，得到測序結(jié)果后，再將序列與峰圖進行比對。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Bioxm軟件將序列轉(zhuǎn)為Fast格式，經(jīng)Seqverter進行整合，用ClustalX 1.83將序列進行分析，與峰圖比對后獲得排列清晰的序列，再用Mega 6.0軟件得出堿基差異、堿基頻率，基于Kimura′s 2-Parameter計算組內(nèi)和組間遺傳距離，并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)樹。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體DNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴增

5種類型鯉魚線粒體DNA D-loop及鄰近區(qū)段PCR擴增均獲得了約1.6 kb的DNA片段。部分

1.3.6 PPCI術(shù)后3月，患者復(fù)查超聲心動圖，了解心功能情況，記錄左室射血分數(shù)（left ventricle ejection fration，LVEF）；觀察LVEF＞50%的發(fā)生率。

個體的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.2 PCR產(chǎn)物序列分析

PCR擴增產(chǎn)物測序后，與峰圖比對，獲得堿基排列順序清晰的DNA片段長度為1342～1344 bp，經(jīng)與GenBank中的KU050703比對，序列中包括tRNAPro區(qū)段13 bp，D-loop區(qū)段928、930 bp或931 bp，tRNAPhe區(qū)段69 bp以及12S rRNA區(qū)段329、331 bp或332 bp。97尾個體中共有8種單倍型，其中6種單倍型的序列提交GenBank，獲得序列號為MG786481～MG786483，MG786485～MG786487，另外兩種與郝君等[5]得到的序列一致，序列號為KC292935、KC292936。

圖1 5種類型鯉魚部分個體的線粒體DNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴增結(jié)果1、2：烏克蘭鱗鯉；3、4：德國鏡鯉；5、6：框鱗鏡鯉；7、8：紅鏡鯉；9、10：州河鯉.

2.3 5種類型鯉魚的堿基差異和堿基組成

2.3.1 堿基差異

5種類型鯉魚8種單倍型間共有28個位點存在堿基差異(表2)。每種單倍型中包含不同類型鯉魚的個體數(shù)(表3)。每種類型鯉魚在單倍型中有一定傾向性，可以將8種單倍型分為2組。單倍型Ⅰ～Ⅳ為第1組，包含烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、紅鏡鯉的全部個體以及框鱗鏡鯉中近70%的個體，其中單倍型Ⅰ和Ⅱ包含了烏克蘭鱗鯉的94.1%、德國鏡鯉的93.75%、框鱗鏡鯉的69.57%、紅鏡鯉的68.42%，占這4種類型鯉魚的80%。單倍型Ⅵ～Ⅷ為第2組，包含州河鯉的90.91%。

表2 鯉魚8種單倍型的堿基差異

表3 5種類型鯉魚在不同單倍型中的分布

2.3.2 堿基組成

使用Mega 6.0軟件分別得出5種類型鯉魚的線粒體DNA D-loop區(qū)段、線粒體DNA D-loop及鄰近區(qū)段的堿基頻率(表4)。A+T的含量明顯高于G+C的含量，這與魚類線粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因的特點[24-25]一致。

2.4 5種類型鯉魚的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.1 單倍型間的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.1.1 D-loop及鄰近區(qū)段的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 5種類型鯉魚D-loop及鄰近區(qū)段的堿基頻率 %

表5 鯉魚8種單倍型的D-loop及鄰近區(qū)段間的遺傳距離

圖2 8種單倍型D-loop及鄰近區(qū)段的鄰接系統(tǒng)樹

2.4.1.2 D-loop區(qū)段的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

將8種單倍型與以上3個GenBank序列以及鯉魚AY345336、AB307063比對，經(jīng)ClustalX軟件比對后獲得926～929 bp的D-loop區(qū)段，單倍型間遺傳距離見表6，構(gòu)建的系統(tǒng)樹見圖3。由表6可見，鯉魚AP017364與單倍型Ⅰ遺傳距離為0，松浦鏡鯉KU050703、鯉魚AY345336與單倍型Ⅱ的遺傳距離為0，鯉魚KJ511883、鯉魚AB307063與單倍型Ⅴ的遺傳距離為0，5種類型鯉魚8種單倍型間的遺傳距離與表5中數(shù)據(jù)相比均有不同程度的增大。由圖3可見，第1組與鯉魚AP017364、AY345336(具有俄羅斯血統(tǒng)的鏡鯉[28-29])、松浦鏡鯉KU050703聚在一起；第2組與鯉魚KJ511883、 AB307063聚在一起，兩組差異明顯。

圖3 8種單倍型D-loop區(qū)段的鄰接系統(tǒng)樹

2.4.2 不同類型鯉魚間的遺傳距離及系統(tǒng)樹

2.4.2.1 D-loop及鄰近區(qū)段的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

用Mega 6.0軟件得出D-loop及鄰近區(qū)段間的組間及組內(nèi)遺傳距離(表7)并構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖4)，由表7可見，德國鏡鯉和框鱗鏡鯉的組內(nèi)遺傳距離分別為0.00462和0.00451，遺傳多樣性最高，烏克蘭鱗鯉和紅鏡鯉的遺傳多樣性稍低于德國鏡鯉和框鱗鏡鯉，州河鯉組內(nèi)遺傳距離為0.00065，遺傳多樣性最低。德國鏡鯉、框鱗鏡鯉與紅鏡鯉距離較小，為0.00458～0.00544；烏克蘭鱗鯉與框鱗鏡鯉、紅鏡鯉距離稍大，為0.00624～0.00684。州河鯉與烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、紅鏡鯉的遺傳距離均約為0.01，與框鱗鏡鯉的遺傳距離稍低，為0.00676；由圖4可見，烏克蘭鱗鯉與鯉魚AP017364，紅鏡鯉與松浦鏡鯉，州河鯉與鯉魚KJ511883聚在一起。

表6 鯉魚8種單倍型的D-loop區(qū)段間的遺傳距離

表7 5種類型鯉魚的D-loop及鄰近區(qū)段間的遺傳距離

圖4 5種類型鯉魚D-loop及臨近區(qū)段的鄰接系統(tǒng)樹

2.4.2.2 D-loop區(qū)段的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹

D-loop區(qū)段的遺傳距離見表8，構(gòu)建的系統(tǒng)樹見圖5。由圖5可見，鯉魚AP017364與烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉聚在一起，松浦鏡鯉KU050703、鯉魚AY345336與紅鏡鯉聚在一起。州河鯉與其他4種類型鯉魚的遺傳距離均約為0.01(表8)，鯉魚KJ511883、AB307063與州河鯉聚在一起。

2.5 5種類型鯉魚的遺傳多樣性指數(shù)

用DnaSp_v5軟件計算出5種類型鯉魚的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)及平均核苷酸差異性，結(jié)果見表9。由表9可見，5種類型鯉魚的單倍型多樣性指數(shù)差異較小；德國鏡鯉和框鱗鏡鯉的核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異性稍大于烏克蘭鱗鯉和紅鏡鯉，州河鯉明顯小于其他4種類型鯉魚。

圖5 5種類型鯉魚D-loop區(qū)段的鄰接系統(tǒng)樹

表8 5種類型鯉魚的D-loop區(qū)段間的遺傳距離

表9 5種類型鯉魚的遺傳多樣性指數(shù)

3 討 論

3.1 5種類型鯉魚中單倍型可分為歐洲血統(tǒng)和亞洲血統(tǒng)

經(jīng)對烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉、紅鏡鯉和州河鯉共5種類型鯉魚的線粒體DNA D-loop及鄰近區(qū)段和僅D-loop區(qū)段的序列分析，共檢測出8種單倍型。單倍型Ⅰ～Ⅳ包含了烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉和紅鏡鯉中90.7%的個體，GenBank上的鯉魚AP017364與單倍型ⅠD-loop區(qū)段，具有俄羅斯血統(tǒng)的鏡鯉AY345336、松浦鏡鯉KU050703與單倍型ⅡD-loop區(qū)段的堿基序列相同，遺傳距離為0。單倍型Ⅰ和單倍型Ⅱ分別占到烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉和紅鏡鯉4種類型鯉魚的24.0%和56.0%，兩者達到4種類型鯉魚的80%。單倍型Ⅲ、Ⅳ與單倍型Ⅰ、Ⅱ遺傳關(guān)系較近。

單倍型Ⅴ～Ⅷ包含了州河鯉的全部個體、框鱗鏡鯉的7個個體。州河鯉為天津市薊州區(qū)于橋水庫中的1種地方野鯉[17-19]，并且單倍型Ⅴ～Ⅷ的組內(nèi)平均遺傳距離僅為0.00099。

因此，筆者認為單倍型Ⅰ～Ⅳ歐洲血統(tǒng)，單倍型Ⅴ～Ⅷ為亞洲血統(tǒng)。至于單倍型Ⅴ中含有框鱗鏡鯉的原因有待進一步探討。

3.2 單倍型間的遺傳差異

歐洲血統(tǒng)的Ⅰ～Ⅳ單倍型間堿基差異位點數(shù)較多，為21個，其中4個缺失或插入，1個轉(zhuǎn)換，16個顛換，單倍型間遺傳距離為0.00224～0.00902，單倍型間遺傳差異較大。亞洲血統(tǒng)的Ⅴ～Ⅷ單倍型間堿基差異位點數(shù)較少，為5個，其中3個缺失或插入，2個顛換，單倍型間遺傳距離為0.00075～0.00149，單倍型間遺傳差異較小。

歐洲血統(tǒng)的單倍型Ⅱ比較特殊，其與其他7種單倍型間的遺傳距離比較相近。單倍型Ⅱ中含有烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉和紅鏡鯉中56.0%的個體，與具有俄羅斯血統(tǒng)的鏡鯉AY345336[24-25]、松浦鏡鯉KU050703的遺傳距離為0，不含有州河鯉。據(jù)此，筆者認為單倍型Ⅱ?qū)儆跉W洲血統(tǒng)。

3.3 5種類型鯉魚遺傳多樣性

烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉、框鱗鏡鯉、紅鏡鯉和州河鯉共5種類型鯉魚中，德國鏡鯉的組內(nèi)遺傳距離、遺傳多樣性指數(shù)最大，遺傳多樣性最高，與胡雪松等[13]對德國鏡鯉的3個群體進行微衛(wèi)星分析，得出德國鏡鯉選育群體仍保持著較高遺傳多樣性的結(jié)論一致。紅鏡鯉與烏克蘭鱗鯉、德國鏡鯉和框鱗鏡鯉相比，組內(nèi)遺傳距離、遺傳多樣性指數(shù)最小，遺傳多樣性最低。

州河鯉組內(nèi)遺傳距離、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異性明顯小于其他4種類型鯉魚，遺傳多樣性較低。州河鯉屬于天津地方野鯉，為天津市薊州區(qū)于橋水庫所特有，其形態(tài)及品質(zhì)和其他鯉魚有很多不同之處[13,30]。可能由于長期生殖隔離，使得州河鯉在小群體的基礎(chǔ)上繁殖，其遺傳多樣性相對較低。這與楊正玲等[30]應(yīng)用線粒體DNA D-loop的RFLP方法分析得出的結(jié)論相同。

作為育種材料，不同類型鯉魚在我國魚類遺傳育種研究以及生產(chǎn)應(yīng)用中占有舉足輕重的地位，至今已培育出很多鯉魚或鯉鯽雜交新品種[2]。所以保護不同類型鯉魚的種質(zhì)資源、促進鯉魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展顯得非常重要。