陳永平，韓現(xiàn)芹，陳 建，李春青，孫曉旺，李 彤，李寶華，付志茹

( 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)，天津 300221 )

隨著人們生活水平的提高，對水產(chǎn)品的消費由溫飽向質(zhì)量轉(zhuǎn)變，人們更關(guān)注水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和新鮮度[1-2]。水產(chǎn)品質(zhì)量安全的挑戰(zhàn)主要集中在生產(chǎn)和流通運輸環(huán)節(jié)。在鮮活水產(chǎn)品長距離運輸過程中因密度大、中途晃動產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，降低了經(jīng)濟價值[3]。為避免損傷和死亡，麻醉劑被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的?；钸\輸中[4-7]。目前漁用麻醉劑已有10余種，其中間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)的麻醉效果最好，對水產(chǎn)品安全無害[8]，但會在水產(chǎn)品中殘留，在人體內(nèi)富集，損害人體生理機能[9-10]。因此使用MS-222后，水產(chǎn)品必須經(jīng)過一段時間的休藥期才能保證安全。為了保證水產(chǎn)品的食用安全性，國際上對MS-222在水產(chǎn)品中的使用進行了嚴(yán)格規(guī)定。如美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，以MS-222麻醉的食用魚必須經(jīng)21 d休藥期才可在市場上銷售[11-12]，加拿大規(guī)定的MS-222休藥期為5 d[13-14]。我國對麻醉劑在水產(chǎn)品中的使用并沒有制定相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)或政策法規(guī)，這給MS-222等的使用及監(jiān)管帶來不便。MS-222對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[8]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]麻醉效果的研究表明，不同水產(chǎn)動物的有效麻醉劑量差別較大[16]，但MS-222在草魚(Ctenopharyngodonidellus)、花鱸(Lateolabraxmaculatus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律的研究尚未見報道。筆者研究了在水溫(22±2) ℃下，草魚、花鱸、鯽魚在MS-222藥浴10 h后各組織中的殘留和消除特點，以確定合理的用藥方案和休藥期，為藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)的限量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為監(jiān)控MS-222殘留和水產(chǎn)品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康草魚、花鱸、鯽魚取自天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，平均體質(zhì)量分別為(100±20) g、(110±20) g和(90±20) g，試驗前暫養(yǎng)7 d。試驗在1.5 m×1.2 m×1.0 m的養(yǎng)殖水箱中進行，注入充分曝氣的自來水體積200 L。水溫保持在(22±2) ℃，每種魚各3水箱，每箱60尾。非藥浴期間，每日8：00和18：00投喂，藥浴期間不換水、不投喂。

MS-222標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，購自美國Sigma-Aldrich公司)；甲醇(Merck公司，色譜純)，甲酸(Merck公司，色譜純)，冰乙酸(國產(chǎn)分析純)，乙酸鈉(國產(chǎn)分析純)；Agela C18固相萃取小柱(6 mL，500 mg，Agela 公司)。

儀器設(shè)備：AB 5500 Qtrap 三重四極桿質(zhì)譜(AB Sciex 公司)；電子天平(Sartorius公司)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；高速組織勻漿機(飛利浦公司，轉(zhuǎn)速10 000 r/min)；MS1 Mini-shaker渦輪振蕩器(IKA公司)；MiLLi-Q純水器(MiLLipore公司)；氮吹儀(Organomation Associates公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司)；移液器(10、20、100、200、1000 μL，Eppendorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)的富集試驗

參考文獻[13,17]，試驗水箱注入充分曝氣的自來水200 L，MS-222質(zhì)量濃度為50 mg/L，水溫保持在(22±2) ℃，分別于藥浴0.5、1、2、3、7 h和10 h時，隨機取出草魚、花鱸、鯽魚各3尾。采樣時，用清潔淡水將魚表面的MS-222藥液沖洗干凈。取2 mL一次性注射器，自胸鰭基部插入心臟取血，放入含有0.3 mL 1%肝素鈉的離心管中，混合均勻后離心，取上層血漿，置于-18 ℃保存。取出肝(胰)臟和魚肉，分別進行均質(zhì)處理，置于-18 ℃保存。

1.2.2 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)的消除試驗

試驗進行10 h后，將草魚、花鱸、鯽魚轉(zhuǎn)入清潔淡水中進行消除試驗，每種魚3個網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱60尾，試驗過程保持充氣，溶解氧>5 mg/L。在0.5、1、2、4、6、8、16、32、96、120、192、264、336、432、528、624、720 h時，每個水箱隨機選取 3 尾，用清潔淡水將魚體表面的 MS-222藥液沖洗干凈。按1.2.1方法采集血液、肌肉、肝(胰)臟樣品，置于-18 ℃保存。

1.3 MS-222測定方法

采集樣品處理：取均質(zhì)好的肌肉、肝(胰)臟各2 g，血液2 mL于50 mL離心管中，各加入10 mL 0.2 mol/mL的乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)和50%甲醇溶液，均質(zhì)。用5 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液和5 mL 50%甲醇溶液清洗刀頭，合并提取液，8000 r/min離心10 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL梨形瓶中，于40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。離心管中剩余殘渣中加入15 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液，渦旋1 min，8000 r/min離心5 min，重復(fù)1次。將上清液與旋蒸后的溶液合并。將待凈化液轉(zhuǎn)移至依次用3 mL甲醇與3 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液活化的固相萃取柱中，用2 mL 7.5%的甲醇溶液淋洗，抽至近干后用2 mL甲醇和1%乙酸溶液的混合液(體積比1∶1)進行洗脫。洗脫液收集于10 mL離心管中，過0.2 μm微孔濾膜后，待測。

MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：稱取10.0 mg的MS-222標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再用甲醇逐級稀釋至2、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制的MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液進行液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。以目標(biāo)物選擇離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

MS-222測定回收率和檢出限：取空白樣品添加一定量的MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，靜置30 min，每組3個平行，再按照樣品處理方法處理后進樣，根據(jù)測定值計算組織中MS-222的含量?？瞻讟悠诽砑恿糠謩e為2、10、100 μg/kg，以MS-222的3倍信噪比(S/N)作為方法檢出限。

色譜—質(zhì)譜條件：色譜柱Shim-pack XR-ODS (2.2 μm，75 mm×2.1 mm)；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相: A-0.1%甲酸，B-乙腈(55∶45，V∶V等梯度洗脫)；流速：0.25 mL/min。電噴霧電離源正離子模式，噴霧電壓4500 V，GS1:60，GS2:40，DP：65，EP:10，CXP:10，掃描模式選擇反應(yīng)監(jiān)測。選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量(表1)。

表1 目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件

注：*為定量碎片離子.

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010計算標(biāo)準(zhǔn)曲線、消除方程及休藥期和繪制。消除方程為：

C=C0e-kt

式中，C表示藥物含量，C0為殘留消除對數(shù)曲線的截距(μg/kg或ng/mL)，k表示消除速率常數(shù)，t代表消除時間(h)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)、方法檢測限及回收率

在1～1000 ng/mL內(nèi)MS-222質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，其線性方程分別為y=1.28×104x-2.84×104，r=0.9999。在本試驗條件下，組織中MS-222檢出限為1.0 μg/kg，MS-222檢出限色譜見圖1，定量限為2.0 μg/kg。各組織中低、中、高3個質(zhì)量濃度加標(biāo)水平的MS-222平均回收率為71.4%～91.2%，表明分析方法滿足要求。

2.2 MS-222在3種魚組織中的富集

藥浴0～3 h時，草魚、花鱸、鯽魚血液、肌肉中MS-222殘留量呈上升趨勢，0～1 h時，上升快速，1～3 h，上升平緩，此階段MS-222的吸收速率略大于代謝速率，但吸收和代謝趨于平衡，藥浴3 h時MS-222含量達到峰值，藥浴3 h后，呈輕微下降趨勢；0～7 h，3種魚肝(胰)臟中MS-222殘留量總體呈上升趨勢，0～2 h，上升趨勢快速，2～7 h，上升趨緩，麻醉劑的吸收和代謝趨于平衡，藥浴7 h時MS-222含量達到峰值，藥浴7 h后，肝(胰)臟中MS-222殘留量輕微下降；3種魚組織中MS-222的殘留量為C血液>C肝(胰)臟>C肌肉；肝(胰)臟中MS-222殘留量達到峰值的時間均比血液和肌肉中延遲了1 h，3種魚組織中MS-222富集殘留量為C鯽魚血液>C草魚血液>C花鱸血液，C草魚肌肉>C花鱸肌肉>C鯽魚肌肉，C鯽魚肝胰臟>C花鱸肝臟>C草魚肝胰臟(表2)。

圖1 魚樣檢出限加標(biāo)色譜圖

表2 水溫(22±2) ℃時草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)MS-222富集殘留量

2.3 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚組織中的消除

在0～720 h內(nèi)，隨時間的遞增，3種魚各組織中MS-222殘留量逐漸降低，在0～8 h內(nèi)MS-222殘留量降低速率尤為明顯，在8～528 h內(nèi)降低速率趨于平緩，624 h后在3種魚血液、肌肉組織中未檢出MS-222殘留，草魚、花鱸、鯽魚肝(胰)臟組織中殘留量分別為3.6、4.8、4.5 μg/kg，在代謝720 h后，3種魚各組織中均未檢出MS-222(表3)。血液和肌肉組織中MS-222代謝速率無明顯差異，肝(胰)臟代謝速率較前兩種組織慢；花鱸富集MS-222殘留較草魚、鯽魚小，草魚、鯽魚組織富集MS-222殘留無明顯差異，MS-222殘留在草魚、花鱸、鯽魚中的消除速率無明顯差異，所有組織中MS-222殘留可以在30 d后代謝完全(表4～表6)，建議在水溫為(22±2) ℃時，MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)的休藥期應(yīng)為30 d以上。

表3 水溫(22±2) ℃時草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)的MS-222消除殘留量

表4 MS-222在草魚組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)

注:AUC(0～t),0～t時間內(nèi)血藥含量—曲線下面積;AUC(0～∞),0～∞時間內(nèi)血藥含量—曲線下面積;MRT(0～t),0～t時間內(nèi)血藥平均滯留時間;MRT(0～∞),0～∞時間內(nèi)血藥平均滯留時間.

表5 MS-222在花鱸組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)

表6 MS-222在鯽魚組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討 論

3.1 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚不同組織中的富集

藥浴會使MS-222富集到草魚、花鱸、鯽魚的不同組織中，血液中MS-222的殘留量較肝(胰)臟和肌肉高，肝(胰)臟中的殘留量高于肌肉。有研究表明，水產(chǎn)魚類腦組織和血液中MS-222的富集程度低于肌肉和肝臟，且消除速度更快[18]。但是，MS-222在魚體的富集和消除規(guī)律也可能與魚體的環(huán)境條件、種類以及藥物含量等因素有關(guān)。這與MS-222在大菱鲆體內(nèi)的富集消除規(guī)律基本一致[5]。血液、肌肉、肝臟中的MS-222富集殘留量分別在藥浴3、3、7 h后達到峰值，隨后草魚、花鱸、鯽魚的血液、肌肉、肝(胰)臟的殘留量分別比峰值下降了4.5%、6.7%、0.9%，6.3%、7.6%、2.6%，4.9%、6.7%、0.9%。10 h內(nèi)血液、肌肉、肝(胰)臟的富集殘留草魚和鯽魚較為接近，分別為2236、2266 ng/mL(血液)，1189、1158 μg/kg(肌肉)，2150、2094 μg/kg(肝胰臟)，草魚和鯽魚組織中MS-222富集殘留量均大于花鱸(1739 ng/mL、1282 μg/kg、1812 μg/kg)。

3.2 MS-222在草魚、花鱸、鯽魚不同組織中殘留量的消除規(guī)律

消除半衰期和藥物平均滯留時間是體現(xiàn)藥物在動物體內(nèi)消除特征的兩個重要參數(shù)(表4)。MS-222在草魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為5.4、6.7、7.9 h；在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中的消除半衰期分別為3.9、5.1、5.7 h；在鯽魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為4.8、6.3、8.4 h。MS-222在草魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時間分別為93.5、96.2、110.6 h；在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中平均滯留時間分別為96.8、96.2、103.1 h；在鯽魚血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時間分別為104.7、112.8、110.5 h。MS-222在各組織中的消除速率為V肝(胰)臟

3.3 MS-222休藥期的確定

MS-222在草魚、花鱸、鯽魚組織中的富集和消除代謝規(guī)律為制定MS-222在水產(chǎn)品中的休藥期提供了科學(xué)依據(jù)。本試驗結(jié)果表明，在水溫(22±2) ℃下，草魚、花鱸、鯽魚組織中的MS-222殘留消除至檢出限以下需要30 d以上，因此，建議在(22±2) ℃時，MS-222在草魚、花鱸、鯽魚體內(nèi)的休藥期應(yīng)為30 d以上。