吳佩佩，孟 陽(yáng)，畢建才，崔青曼，袁春營(yíng)

( 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院，天津市海洋環(huán)境保護(hù)與修復(fù)技術(shù)工程中心，天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津 300457 )

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對(duì)蝦，原產(chǎn)于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥灣沿岸，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所于1988年自美國(guó)夏威夷引進(jìn)中國(guó)，現(xiàn)已在全國(guó)廣泛養(yǎng)殖。但隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，對(duì)蝦品種明顯退化，對(duì)病害的抵抗力降低，加上養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，致使病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

由于抗生素之類的藥物已受到嚴(yán)格控制，所以國(guó)內(nèi)外學(xué)者和養(yǎng)殖戶把目光聚焦在免疫增強(qiáng)劑上，希望通過(guò)提高養(yǎng)殖對(duì)蝦機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)其抵抗病害和應(yīng)激的能力，提升對(duì)蝦養(yǎng)殖成功率和養(yǎng)殖水平[1-6]。

擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)為一類經(jīng)典的絲狀放線菌群，其基絲異常發(fā)達(dá)，能夠斷裂成桿狀或球狀，氣絲發(fā)育良好，多為長(zhǎng)或短的分枝，Meyer[7]最早對(duì)于該類菌進(jìn)行過(guò)描述，截止到2015年12月，擬諾卡氏菌屬已公開發(fā)表的新種為42個(gè)、亞種為2個(gè)[8]。擬諾卡氏菌屬細(xì)胞壁組分Ⅲ型，主要由肽聚糖組成。筆者自凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥中分離出1株擬諾卡氏菌，經(jīng)過(guò)16S rDNA同源序列分析，確定為盧森坦擬諾卡氏菌(N.lucentensis)，將該菌株制備的細(xì)胞壁骨架制劑應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖，探討其對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)及免疫功能的影響，以期為凡納濱對(duì)蝦新型免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架

本試驗(yàn)室分離純化的盧森坦擬諾卡氏菌發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)超聲波破碎、離心、胰蛋白酶酶解、脫脂、冷凍干燥，得到白色細(xì)胞壁骨架。

1.1.2 凡納濱對(duì)蝦

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自天津鑫永豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體長(zhǎng)(6.86±1.32) cm，體質(zhì)量(4.21±1.28) g。

1.1.3 試驗(yàn)用試劑盒

所有試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料為自行配制，基礎(chǔ)配方見表1。飼料原料經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，各原料按配比定量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經(jīng)雙螺桿擠條機(jī)擠壓出直徑為1.0 mm的飼料，60 ℃烘干后剪切成1.5 mm長(zhǎng)的顆粒貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料基礎(chǔ)配方 %

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)細(xì)胞壁骨架組，添加量分別為0.1%和0.2%，1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，共計(jì)9個(gè)處理組。水族箱規(guī)格720 mm×490 mm×380 mm，每個(gè)水族箱中投放對(duì)蝦30尾。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)持續(xù)4周，投餌量按照對(duì)蝦體質(zhì)量的4%～6%進(jìn)行投喂，日投喂4次(6:00、11:00、16:00和21:00)，各時(shí)間點(diǎn)投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫27～29 ℃，鹽度18～20，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

1.2.3 對(duì)蝦樣品的采集與指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

4周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，分別對(duì)每個(gè)處理組對(duì)蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱量質(zhì)量，計(jì)算對(duì)蝦的存活率及特定生長(zhǎng)率：

存活率/%=nt/n0×100%

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，n0和nt分別為每個(gè)重復(fù)對(duì)蝦初始尾數(shù)和終末尾數(shù)，m0和mt分別為初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量，t為試驗(yàn)時(shí)間。

1.2.3.2 抗凝血的制備

用1 mL的無(wú)菌注射器，按照血淋巴與抗凝劑為1∶2的比例，由每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取出10～12尾蝦，從腹竇部位進(jìn)行取血。所取抗凝血，一部分直接用于呼吸爆發(fā)活性的測(cè)定，另一部分離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶活力的測(cè)定，另一部分放于-70 ℃超低溫冰箱中保存，用于其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3.3 肝胰腺組織勻漿的制備

將抽取血液后的對(duì)蝦解剖，取出肝胰腺，置于5 mL離心管中，將肝胰腺置于冰水浴中，加入9倍體積0.05 mol/L、 pH 6.5的磷酸鹽緩沖液放入組織勻漿器中進(jìn)行勻漿，勻漿液經(jīng)3000 r/min離心15 min，上清液即為10%肝胰腺組織勻漿，取勻漿液少許，按照南京建成試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定勻漿液中可溶性蛋白質(zhì)含量，其余的4 ℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶的活性

南京建成試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶的活性。血清中超氧化物歧化酶活力單位定義：每毫升反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶量為1個(gè)超氧化物歧化酶活力單位(U)；肝胰腺中超氧化物歧化酶活力單位定義：每毫克蛋白質(zhì)中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的超氧化物歧化酶量為1個(gè)超氧化物歧化酶活力單位(U)。

1.2.3.5 一氧化氮合酶活性

南京建成試劑盒測(cè)定一氧化氮合酶活性。血清中一氧化氮合酶活力單位定義：每毫升血清每分鐘生成1 nmol一氧化氮為1個(gè)酶活力單位(U)；肝胰腺中一氧化氮合酶活力單位定義：每毫克組織蛋白質(zhì)每分鐘生成1 nmol一氧化氮為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.3.6 丙二醛活性

南京建成試劑盒測(cè)定丙二醛的濃度。測(cè)定原理：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫化巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，由此測(cè)定丙二醛的濃度。

1.2.3.7 酚氧化酶活性

參照南京建成蝦酚氧化酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中對(duì)蝦酚氧化酶水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中對(duì)蝦酚氧化酶的活性。

1.2.3.8 溶菌酶活性

南京建成試劑盒測(cè)定溶菌酶活性。測(cè)定原理：在一定密度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖使細(xì)菌裂解，體系密度降低，透光度增強(qiáng)，根據(jù)透光度變化推測(cè)溶菌酶活性(1 μg=80 U)。

1.2.3.9 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性

南京建成試劑盒測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性。血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力單位定義：每0.1 mL血清在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位(U)；肝胰腺中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力單位定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.3.10 呼吸爆發(fā)活性

參考文獻(xiàn)[9]的方法略有改動(dòng)。取100 μL抗凝血，加入100 μL(1 μg/mL)佛波醇—肉豆蔻酸—乙酯，37 ℃溫育30 min，然后加入100 μL 0.3%氯化硝基四氮唑藍(lán)，37 ℃溫育30 min，5000 r/min，4 ℃，離心10 min，去除上清液，加入200 μL純甲醇終止反應(yīng)，10 min后，5000 r/min，4 ℃，離心10 min，去除上清液，然后用70%甲醇反復(fù)洗滌3次，最后一次離心去除上清液后，于室溫下晾干，經(jīng)干燥后，加入120 μL 12 mol/L KOH和140 μL二甲基亞砜，充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定630 nm處的吸光值(OD630)。呼吸爆發(fā)活性表示為OD630。

1.2.4 攻毒試驗(yàn)

投喂28 d后，對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組剩下的對(duì)蝦各取11尾進(jìn)行攻毒，第3腹節(jié)肌肉注射副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)菌懸液(1.2×108cfu/mL) 0.1 mL，對(duì)照組中注射相同劑量的生理鹽水，記錄接種7 d后各組對(duì)蝦的累積死亡率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)及存活率的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各處理組對(duì)蝦死亡尾數(shù)，測(cè)定各存活對(duì)蝦體質(zhì)量，計(jì)算存活率和特定生長(zhǎng)率，結(jié)果見圖1、圖2。添加0.1%骨架制劑的凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和存活率最高，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，0.2%骨架制劑添加組對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和存活率極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。由此可見，飼料中添加擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑，能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和成活率，且以0.1%的添加最適宜。

圖1 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率比較*>*表示與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01).下同.

圖2 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的存活率比較

2.2 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶活性的影響

對(duì)不同處理組的對(duì)蝦進(jìn)行了血清和肝胰腺中超氧化物歧化酶活性的分析比較，結(jié)果見表2。擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架均能極顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中超氧化物歧化酶的活性(P<0.01)，添加0.1%的擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶的活性(P<0.05)。

表2 不同處理組凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶活性比較

注：*表示與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)；*>*表示與對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01).下同.

2.3 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦一氧化氮合酶活性的影響

一氧化氮既可通過(guò)殺傷、抑制病原體發(fā)揮抗感染的作用，同時(shí)也參與對(duì)宿主免疫病理的調(diào)節(jié)，一氧化氮的合成有賴于一氧化氮合酶的催化作用。不同處理組凡納濱對(duì)蝦一氧化氮合酶活性測(cè)定結(jié)果表明，擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑均能顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清及肝胰腺組織中的一氧化氮合酶活性(P<0.05，P<0.01)(表3)。

表3 不同處理組凡納濱對(duì)蝦一氧化氮合酶活性比較

2.4 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛的影響

生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，其會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。不同處理組凡納濱對(duì)蝦丙二醛測(cè)定結(jié)果表明，擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑的添加均能極顯著降低凡納濱對(duì)蝦血清及肝胰腺組織中的丙二醛濃度(P<0.01)(表4)。

表4 不同處理組凡納濱對(duì)蝦丙二醛濃度的比較

2.5 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶活性的影響

不同處理組凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果見表5，飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺組織中的酚氧化酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，雖然也能顯著提高對(duì)蝦血清和肝胰腺組織中的酚氧化酶活性(P<0.05)，但作用程度弱于0.1%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架添加組。

表5 不同處理組凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶活性的比較

2.6 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶活性的影響

飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺組織中的溶菌酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能夠極顯著提高對(duì)蝦血清中的溶菌酶活性(P<0.01)，明顯提高對(duì)蝦肝胰腺組織中溶菌酶

活性，但未達(dá)顯著性差異水平(P>0.05)(表6)。

表6 不同處理組凡納濱對(duì)蝦溶菌酶活性的比較

2.7 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響

不同處理組凡納濱對(duì)蝦谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定結(jié)果見表7。飼料中添加0.1%和0.2%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，均能夠顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺組織中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性(P<0.05，P<0.01)。

表7 不同處理組凡納濱對(duì)蝦谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的比較

2.8 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦血液呼吸爆發(fā)活性的影響

飼料中添加0.1%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能夠極顯著提高凡納濱對(duì)蝦血淋巴中的呼吸爆發(fā)活性(P<0.01)，添加0.2%擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，能顯著提高對(duì)蝦血淋巴中呼吸爆發(fā)活性(P<0.05)(表8)。

表8 不同處理組凡納濱對(duì)蝦呼吸爆發(fā)活性的比較

2.9 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦攻毒死亡率的影響

對(duì)于各處理組剩余的凡納濱對(duì)蝦，各取11尾進(jìn)行副溶血弧菌攻毒試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果見圖3，與對(duì)照組比較，對(duì)蝦飼料中添加細(xì)胞壁骨架后，對(duì)蝦死亡率明顯降低，0.1%添加組的死亡率為54.55%，0.2%添加組的死亡率為63.64%，而對(duì)照組的死亡率高達(dá)81.82%，由此可見，細(xì)胞壁骨架可以明顯提高凡納濱對(duì)蝦的機(jī)體免疫力，從而降低攻毒死亡率。

圖3 副溶血弧菌攻毒后不同處理組凡納濱對(duì)蝦死亡率的比較

3 討 論

3.1 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶活性的影響

β-葡聚糖、肽聚糖和免疫多糖等，具有提高蝦類免疫功能的作用[10-13]。甲殼動(dòng)物具有脂多糖受體蛋白、葡聚糖受體蛋白等多種受體結(jié)合蛋白，這些受體蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合特定的免疫多糖，誘發(fā)機(jī)體的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，進(jìn)而產(chǎn)生酚氧化酶，在氧分子存在下，該酶能把酚類氧化成成醌，醌類可抑制微生物的感染；同時(shí)，免疫多糖還可以刺激顆粒細(xì)胞脫顆粒釋放出免疫活性物質(zhì)，增強(qiáng)血細(xì)胞的吞噬活性，提高消滅病原體的能力[14]。劉小玲等[15]通過(guò)研究樺褐孔菌多糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和血清免疫相關(guān)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖能夠顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦幼蝦的生長(zhǎng)，增強(qiáng)對(duì)蝦血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性和總抗氧化能力，降低血清丙二醛含量；飼料中添加美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)，也能夠提升凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫水平，增強(qiáng)抵抗疾病的能力[16]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦飼料中添加擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，可能誘發(fā)了對(duì)蝦機(jī)體的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，從而顯著增強(qiáng)了凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶的活性，抑制了副溶血弧菌的感染，降低了攻毒后的死亡率。

3.2 細(xì)胞壁骨架對(duì)凡納濱對(duì)蝦生化活性的影響

超氧化物歧化酶是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶；一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮既可以通過(guò)殺傷、抑制病原體發(fā)揮抗感染的作用，又可以參與對(duì)宿主免疫病理的調(diào)節(jié)[17]；丙二醛濃度的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致使細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物逸出，細(xì)菌溶解；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能催化谷胱甘肽變?yōu)檠趸凸入赘孰模褂卸镜倪^(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害；呼吸爆發(fā)是氧依賴性吞噬細(xì)胞殺菌途徑之一，常常作為衡量吞噬細(xì)胞活力的重要指標(biāo)之一。本研究中采用超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、丙二醛、溶菌酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和血液呼吸爆發(fā)活性作為凡納濱對(duì)蝦的免疫學(xué)指標(biāo)，研究了擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架對(duì)這些免疫學(xué)指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1%含量的擬諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑顯著提高除丙二醛濃度外的凡納濱對(duì)蝦系列免疫指標(biāo)的活性，顯著降低丙二醛濃度，從而提高了對(duì)蝦的機(jī)體免疫力和養(yǎng)殖成活率，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，增加骨架制劑的使用量，并未增強(qiáng)對(duì)蝦免疫指標(biāo)的活性，反而有所降低，分析原因，可能是產(chǎn)生了免疫疲勞?？傊?，適量的細(xì)胞壁骨架制劑有望作為一種新型對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑被進(jìn)一步開發(fā)利用。