羅非魚無(wú)乳鏈球菌拮抗株的篩選及特性研究

王 蕊，付維來(lái)，陳 思，陳 晶，易敢峰

( 1.福建大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司，福建 漳州 363500；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080 )

2016年全國(guó)羅非魚(Oreochromis)養(yǎng)殖量為1.866×106t，比2015年提高了4.88%，穩(wěn)居世界首位。羅非魚生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)，是淡水養(yǎng)殖優(yōu)秀品種。但是近年來(lái)，全球性羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]?？股豙3]一直是防控該病的首選，但是抗生素的殘留及病原菌耐藥性等問題突顯，威脅養(yǎng)殖環(huán)境和人類的健康。

益生菌以安全、有效的特性受到廣泛的研究與應(yīng)用。據(jù)已有研究報(bào)道，對(duì)羅非魚鏈球菌有抑制作用的菌株涉及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、諾卡氏菌(Nocardiasp.)及植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)等[4-8]。諸多研究表明，芽孢桿菌具有拮抗致病菌、凈化池塘水質(zhì)、提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的效果[9-11]。因此，芽孢桿菌以其適應(yīng)性強(qiáng)、耐加工、生長(zhǎng)快、分布廣，且具有較多的生物學(xué)特性，如分泌多種生物酶、降解亞硝酸鹽和氨態(tài)氮、產(chǎn)生抑制有害菌生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物等，被廣泛用于飼料添加劑及水質(zhì)改良中。

筆者在點(diǎn)種法和牛津杯法的基礎(chǔ)上進(jìn)行拮抗株篩選方法的改進(jìn)，從吉富羅非魚(O.niloticusGIFT)腸道中分離篩選出一株安全、顯著抑制無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的土著芽孢桿菌，進(jìn)行亞硝酸鹽降解能力、產(chǎn)酶能力、藥敏性等生物學(xué)特性檢測(cè)以及最佳抑菌活性與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系研究，旨在為當(dāng)?shù)亓_非魚鏈球菌病防治提供良好的菌種資源及該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

指示菌為本實(shí)驗(yàn)室分離的無(wú)乳鏈球菌S-2，來(lái)自福建鏈球菌發(fā)病癥狀典型的瀕死羅非魚魚體。待分離樣品來(lái)自福建漳州，主要針對(duì)第1年羅非魚鏈球菌病高發(fā)，第2年仍然養(yǎng)殖羅非魚品種的養(yǎng)殖池塘。共采集6口池塘的底泥、水樣及健康羅非魚腸道樣品共計(jì)18份，采集地點(diǎn)為漳州市區(qū)、漳浦縣、云霄縣、長(zhǎng)泰縣、南靖縣。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、新鮮一次性兔血瓊脂平板、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基、淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基[12]、發(fā)酵培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米面5 g/L，蛋白胨10 g/L，蔗糖4 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水合硫酸亞鐵0.25 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，一水合硫酸錳0.25 g/L，碳酸鈣1 g/L，消泡劑0.5 mL/L；pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

(1)底泥樣：取約1 g池塘泥樣溶解在10 mL無(wú)菌水中振蕩均勻，85 ℃水浴加熱15 min。

(2)水樣：取20 mL池塘水樣，85 ℃水浴加熱15 min。

(3)羅非魚腸道樣品：用鑷子將生理鹽水中的羅非魚腸道取出至10 mL無(wú)菌水中充分研磨，85 ℃水浴加熱15 min。

各樣品均梯度稀釋后涂平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。將平板生長(zhǎng)的菌株分離純化作為供試菌株。

1.2.2 溶血性檢測(cè)

溶血試驗(yàn)是檢測(cè)供試菌株是否對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞產(chǎn)生溶解反應(yīng)，是益生菌安全性評(píng)價(jià)的一部分。將供試菌株接種到新鮮的兔血瓊脂平板上，放于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，篩選無(wú)溶血性的菌株進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2.3 拮抗株的篩選

(1)指示菌涂布平板法：無(wú)乳鏈球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中。37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，取100 μL無(wú)乳鏈球菌菌液按10-2稀釋度稀釋并涂板，將供試菌株點(diǎn)于平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。觀察抑菌圈，初步篩選出有抑菌效果的菌株。

(2)指示菌倒平板法：將無(wú)乳鏈球菌及初步篩選的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。為了找到無(wú)乳鏈球菌菌液最適接種密度及培養(yǎng)基最適澆注量，設(shè)置接種密度為106、107cfu/mL和108cfu/mL，接種量均為50 μL，分別加入到還未凝固的LB固體培養(yǎng)基中(20、25 mL和30 mL)，搖勻，傾倒至已放有牛津杯的平板中，待培養(yǎng)基凝固取出牛津杯。向孔中加入過濾除菌的發(fā)酵上清液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀察抑菌圈大小。

(3)拮抗株抑菌物質(zhì)的抑菌活性對(duì)溫度的耐受性：取發(fā)酵液10 mL，過濾除菌保留上清液，分別于60、80、100、120 ℃處理30 min，自然冷卻后指示菌倒平板法測(cè)抑菌活性。以37 ℃培養(yǎng)不做任何處理的發(fā)酵上清液做對(duì)照。

1.2.4 菌種鑒定

1.2.4.1 菌體形態(tài)觀察

革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化鑒定

方法參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[13]進(jìn)行。

1.2.4.3 16S rRNA 基因測(cè)序

利用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增，16S rRNA基因PCR引物：正向引物27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，對(duì)應(yīng)于大腸桿菌(Escherichiacoli)第8～27堿基位置；反向引物P6，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，對(duì)應(yīng)于大腸桿菌第1492～1510堿基位置。目的條帶為1.5 kb，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并測(cè)序，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，得到未知菌與基因庫(kù)中已知菌的相似度，用鄰接法進(jìn)化樹分析該菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.5 最佳抑菌活性與發(fā)酵時(shí)間關(guān)系的測(cè)定

將待測(cè)菌株進(jìn)行30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，每隔4 h取發(fā)酵液鏡檢芽孢產(chǎn)生情況并檢測(cè)抑菌活性，分析發(fā)酵時(shí)間與抑菌活性的關(guān)系。

1.2.5.1 種子液制備

一級(jí)種子液：挑取菌株單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子液：吸取1 mL一級(jí)種子液于100 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

將上述制備的二級(jí)種子液以1%的接入量接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速70～100 r/min，灌壓0.5 Mpa，通風(fēng)比1∶0.6～1∶0.4，pH5.5～7.5，發(fā)酵時(shí)間16～20 h。

1.2.6 生物酶檢測(cè)

將待測(cè)菌點(diǎn)種于蛋白酶檢測(cè)平板上，以透明圈大小顯示該菌株產(chǎn)蛋白酶活力。

將待測(cè)菌點(diǎn)種于纖維素酶檢測(cè)平板上，培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基中倒入剛果紅溶液(1 mg/mL)染色10～15 min，倒掉剛果紅溶液，加入1 mol/L的NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液。根據(jù)透明圈大小判斷纖維素酶活力。

將待測(cè)菌點(diǎn)種于淀粉酶檢測(cè)平板上，培養(yǎng)24 h后固體碘熏蒸著色。具體方法：取1 g固體碘均勻平鋪在白紙上，將培養(yǎng)好的平皿倒置在固體碘上熏蒸30 s，并均勻轉(zhuǎn)動(dòng)。淀粉遇碘變?yōu)樗{(lán)色，根據(jù)透明圈大小判斷淀粉酶活力大小。

1.2.7 亞硝酸鹽降解試驗(yàn)

1.2.7.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽溶液(0～4 mg/L)，置于酶標(biāo)儀下測(cè)量550 nm處吸光值(OD550)，作亞硝酸鹽質(zhì)量濃度與OD550的對(duì)應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.2 亞硝酸鹽檢測(cè)培養(yǎng)基

蒸餾水50 mL，魚料0.05 g，2.5 mg/L的亞硝酸鈉溶液50 μL。121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。試驗(yàn)組接種50 μL菌液(終密度為105cfu/mL)，對(duì)照組加50 μL生理鹽水，每組3個(gè)平行置于37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，格里斯試劑法測(cè)定OD550，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度。

1.2.8 藥敏試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)

1.2.8.1 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。待測(cè)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，菌液密度約108cfu/mL，取10-2稀釋度100 μL菌液涂布平板，取藥敏片均勻放于平板中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察抑菌圈。

1.2.8.2 安全性檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[14]，采用背部肌肉注射法進(jìn)行菌種安全性檢測(cè)。設(shè)對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行。每個(gè)平行組10尾羅非魚，平均質(zhì)量為(8.3±1.4) g。試驗(yàn)組每尾羅非魚分別注射1×109、1×108、1×107cfu/mL的菌液200 μL，對(duì)照組注射同等量的生理鹽水，正常飼喂7 d，觀察羅非魚的死亡情況。

1.2.9 菌株LT3-1對(duì)無(wú)乳鏈球菌的影響

試驗(yàn)用魚為吉富羅非魚，采用循環(huán)水養(yǎng)殖，規(guī)格一致的羅非魚120尾，分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，每組平行20尾，初始體質(zhì)量(46.91±0.17) g。對(duì)照組只飼喂飼料，試驗(yàn)組飼喂添加菌株LT3-1的飼料，菌粉活菌含量1010cfu/g，添加量0.05%。養(yǎng)殖4周后采取攻毒試驗(yàn)，腹腔注射密度為1×108cfu/mL的無(wú)乳鏈球菌S-2菌液0.2 mL，每日觀察并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)魚的發(fā)病情況，記錄攻毒后14 d內(nèi)的死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)過分離純化18份樣品，初步得到77株芽孢菌。池水、底泥及健康羅非魚腸道中各得到20、29、28株芽孢菌(表1)。

表1 樣品的菌株分離數(shù)量

2.2 溶血性檢測(cè)

經(jīng)過血瓊脂板培養(yǎng)，共篩選到30株無(wú)溶血性芽孢菌，并用于抑菌能力檢測(cè)。

2.3 拮抗菌株篩選

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，指示菌的接種密度以及平板培養(yǎng)基的薄厚影響抑菌圈的大小。因此本試驗(yàn)進(jìn)行了指示菌的接種密度及平板培養(yǎng)基澆注量(20、25、30 mL)的探索。最終確定25 mL培養(yǎng)基與1×107cfu/mL指示菌50 μL混勻制板，得到的抑菌圈最清晰。經(jīng)篩選，5株芽孢菌具有抑制無(wú)乳鏈球菌的能力，其中菌株LT3-1抑菌效果最強(qiáng)且穩(wěn)定，抑菌圈平均直徑可達(dá)(25.30±0.57) mm(圖1)，因此，對(duì)菌株LT3-1進(jìn)行進(jìn)一步研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株LT3-1抑菌物質(zhì)活性隨著溫度的升高(60、80、100、120 ℃)逐漸減弱，與不做任何處理的發(fā)酵上清液對(duì)照比較，抑菌圈直徑自26.65 mm降至10.10 mm，但依然存在抑菌活性(圖2)。說(shuō)明菌株LT3-1抑菌物質(zhì)在一定程度上可以耐受較高的溫度，此特點(diǎn)使該菌在發(fā)酵液后處理工藝上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 菌株LT3-1發(fā)酵上清液抑菌活性使用SCAN 1200，6.1.3.0版分析的樣品.

圖2 溫度對(duì)菌株LT3-1抑菌物質(zhì)活性的影響

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察

菌株LT3-1在37 ℃，LB平板上生長(zhǎng)為扁平、邊緣不整齊的白色菌落。革蘭氏染色陽(yáng)性，長(zhǎng)桿狀(圖3a)。芽孢形態(tài)見圖3b，菌體膨大，中間呈現(xiàn)空心狀。

2.4.2 生理生化測(cè)定及16S rRNA基因序列鑒定

菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10T[13]的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可見，菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10T的測(cè)定結(jié)果相同。

菌株LT3-1 16S rRNA基因測(cè)序后，得到的序列長(zhǎng)度為1420 bp，比對(duì)結(jié)果表明，該菌與枯草芽孢桿菌BGSC 3A28最近，相似性為99%。采用Mega 4.0軟件鄰接法構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式種DSM10T聚在同一分支，結(jié)合生理生化結(jié)果，菌株LT3-1鑒定為枯草芽孢桿菌，16S rRNA基因GenBank序列號(hào)為MG719524。

表2 菌株LT3-1生理生化特征

圖3 菌株LT3-1鏡下形態(tài)示意a.普通狀態(tài)下的菌體； b.產(chǎn)生芽孢的菌體.

圖4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 最佳抑菌活性與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系

枯草芽孢桿菌LT3-1隨著發(fā)酵時(shí)間的增加抑菌活性增加，發(fā)酵4 h后，上清液出現(xiàn)較弱抑菌活性(圖5)。16～20 h時(shí)抑菌活性較強(qiáng)，雖有上升，但是上升程度較小，基本保持穩(wěn)定。經(jīng)顯微鏡觀察，枯草芽孢桿菌LT3-1發(fā)酵16 h出孢完全，因此，出孢率與抑菌活性存在一定的正相關(guān)性。

2.6 生物酶檢測(cè)

試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌LT3-1可以水解酪蛋白，形成直徑為9 mm的透明圈(圖6a)，說(shuō)明該菌具有分泌蛋白酶的能力；淀粉平板遇碘顯藍(lán)色，而菌落周圍出現(xiàn)直徑9 mm透明圈(圖6b)，說(shuō)明該菌具有分泌淀粉酶的能力；纖維素酶平板經(jīng)剛果紅染色，菌落周圍形成直徑12 mm的透明圈(圖6c)，說(shuō)明該菌具有水解羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的能力，可以分泌纖維素酶。

圖5 枯草芽孢桿菌LT3-1抑菌活性及出孢率隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖6 枯草芽孢桿菌LT3-1水解酪蛋白(a)、淀粉(b)及羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(c)結(jié)果

2.7 亞硝酸鹽降解試驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，密度為105 cfu/mL的枯草芽孢桿菌LT3-1可以顯著降低亞硝酸鹽水平，6 h即可將亞硝酸鹽質(zhì)量濃度由2.5 mg/L降至0.03 mg/L(圖7)，亞硝酸鹽降解率可以達(dá)98.8%，凈水效果顯著(P<0.05)。

2.8 藥敏試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)

2.8.1 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)檢測(cè)了枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)7個(gè)類型9種抗生素的敏感性。檢測(cè)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)所檢測(cè)的9種抗生素紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、四環(huán)素、氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、氯霉素、利福平均表現(xiàn)為敏感(表3)。

圖7 枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)亞硝酸鹽的降解效果

表3 枯草芽孢桿菌LT3-1藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 安全性試驗(yàn)

經(jīng)過1周的安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明，肌肉注射密度為1×107cfu/mL的枯草芽孢桿菌LT3-1菌液后，羅非魚可以正常存活，無(wú)異常現(xiàn)象。

2.9 枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)無(wú)乳鏈球菌感染的影響

攻毒試驗(yàn)第6 d后出現(xiàn)死亡情況，死亡高峰期出現(xiàn)在攻毒后的第7～9 d(圖8)。對(duì)照組的成活率為(73.33±6.67)%，顯著低于試驗(yàn)組(93.33±3.33)%，(P<0.05)。表明枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)無(wú)乳鏈球菌感染吉富羅非魚的拮抗效果顯著。

圖8 攻毒14 d內(nèi)試驗(yàn)魚的存活率

3討 論

羅非魚鏈球菌病病原主要為海豚鏈球菌(S.iniae)和無(wú)乳鏈球菌，2009年后主要流行病原為無(wú)乳鏈球菌，有新的株型和克隆系出現(xiàn)[15-17]，但并未發(fā)現(xiàn)有菌種變化。因此本研究以羅非魚無(wú)乳鏈球菌為指示菌株進(jìn)行拮抗菌的篩選。

劉觀斌等[9]篩選出1株拮抗菌——蠟樣芽孢桿菌NY5，對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑制圈直徑達(dá)26.67 mm，對(duì)50 mg/L的亞硝酸鹽氮12 h去除效率達(dá)到100%。李仕成[5]篩選到1株解淀粉芽孢桿菌J4，對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑制圈直徑達(dá)16 mm，并且發(fā)現(xiàn)，飼料中添加107cfu/g和108cfu/g的解淀粉芽孢桿菌J4，可顯著降低餌料系數(shù)，提高羅非魚的質(zhì)量增加率、生長(zhǎng)性能、非特異性免疫力及抗氧化能力。由此可見，芽孢桿菌可同時(shí)具備拮抗無(wú)乳鏈球菌和凈水、促生長(zhǎng)、提高免疫力的功能。本研究通過體內(nèi)和體外兩種方式對(duì)篩選到的枯草芽孢桿菌LT3-1的拮抗無(wú)乳鏈球菌效果進(jìn)行了分析，體外抑菌圈直徑達(dá)(25.30±0.57) mm；體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)表明，添加枯草芽孢桿菌LT3-1的試驗(yàn)組羅非魚攻毒后存活率達(dá)93.33%，顯著高于對(duì)照組(73.33%)(P<0.05)?？莶菅挎邨U菌LT3-1具備快速降解水體亞硝酸鹽的能力，2.5 mg/L的亞硝酸鹽氮6 h降解率達(dá)98.8%，高于枯草芽孢桿菌HAINUP40[18]的降亞硝酸鹽能力(12 h亞硝酸鹽去除率94.12%)。枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫力及抗氧化能力方面的研究還有待開展。

益生菌對(duì)病原菌的拮抗作用方式并不相同。乳酸菌可通過分泌有機(jī)酸降低周圍環(huán)境pH或分泌過氧化氫、雙乙酰、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物達(dá)到抑制病原菌的效果[19-20]。有些芽孢桿菌也可以通過分泌有機(jī)酸抑制病原菌如凝結(jié)芽孢桿菌。但是大多數(shù)芽孢桿菌一般通過分泌脂肽類、聚酮類、蛋白類抑菌物質(zhì)發(fā)揮對(duì)病原菌的抑菌作用。連燕萍[21]研究表明，解淀粉芽孢桿菌MG-3的抑菌物質(zhì)L-1為脂肽類抗生素IturinA。分離自海參腸道的枯草芽孢桿菌HS-A38分泌的抑菌物質(zhì)為直鏈抗菌脂肽，主要組分為桿菌霉素Bacillomycin D[22-24]。陳輝[7]發(fā)現(xiàn)1株諾卡氏菌可以顯著抑制海豚鏈球菌的生長(zhǎng)，其抑菌物質(zhì)耐高溫，對(duì)蛋白酶敏感，具有酸堿穩(wěn)定性，硫酸銨沉淀試驗(yàn)證明為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。本研究中篩選得到的枯草芽孢桿菌LT3-1的抑菌物質(zhì)可以耐受較高溫度。其過濾除菌后的發(fā)酵上清液具有顯著的抑菌活性，說(shuō)明枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑制作用并不是通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)而是通過分泌抑菌物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，其抑菌物質(zhì)的主要組分需進(jìn)一步研究。其次，該菌發(fā)酵0～4 h時(shí)，發(fā)酵上清液抑菌活性雖然有提高但是處于較弱的水平，發(fā)酵4～16 h為對(duì)數(shù)期，其上清液抑菌活性明顯增強(qiáng)，在發(fā)酵16 h時(shí)芽孢產(chǎn)生完全，達(dá)到穩(wěn)定期，其抑菌活性也達(dá)到最大，推測(cè)該菌的抑菌物質(zhì)可能為次級(jí)代謝產(chǎn)物，可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)獲取代謝產(chǎn)物，建議發(fā)酵終點(diǎn)為16 h。

溶血是致病菌的致病機(jī)理之一，與動(dòng)物安全性共同被認(rèn)為是益生菌安全性評(píng)價(jià)的重要方面[25-27]。諸多學(xué)者把溶血性、常見抗生素敏感性及對(duì)宿主的安全性納為安全性評(píng)估指標(biāo)中。王曉琳等[28]研究表明，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)VZ5株均未表現(xiàn)出溶血特征，且對(duì)多數(shù)常見抗生素敏感或中度敏感。在106cfu/mL菌液密度下，兩株菌未對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)表現(xiàn)出明顯的毒害作用。本研究篩選到的枯草芽孢桿菌LT3-1亦無(wú)溶血現(xiàn)象，對(duì)檢測(cè)的9種抗生素均敏感，在107cfu/mL菌液注射密度下對(duì)羅非魚安全。因此，該菌株可以應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

4 結(jié) 論

綜上所述，篩選自吉富羅非魚腸道的枯草芽孢桿菌LT3-1對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑菌圈直徑達(dá)(25.30±0.57) mm，攻毒后，飼喂含枯草芽孢桿菌LT3-1飼料的羅非魚存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。該菌發(fā)酵16 h抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌物質(zhì)可以耐受較高溫度?？莶菅挎邨U菌LT3-1具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的能力，可以在提高餌料利用率、維護(hù)腸道消化健康方面發(fā)揮作用；該菌具有快速降低水體亞硝酸鹽水平的能力；該菌分離自健康羅非魚腸道，無(wú)溶血，對(duì)羅非魚安全可靠，可以作為當(dāng)?shù)亓_非魚無(wú)乳鏈球菌防控及凈化水質(zhì)方面的良好材料。