基于下一代測序技術分析巴氏殺菌乳中殘留細菌在貯藏期間的動態(tài)變化

丁瑞雪，耿麗娟，張鐵華，孫雪姣，岳喜慶，武俊瑞,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽市食品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；3.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

巴氏殺菌乳是通過低溫殺菌的一種乳品，具有新鮮、營養(yǎng)、原味、安全、環(huán)保等優(yōu)勢，在奶業(yè)發(fā)達國家消費中占據(jù)主導地位，如加拿大、美國、澳大利亞、日本等國巴氏殺菌乳所占比例均達90%以上[1-3]。由于巴氏牛乳的處理方法比較溫和，較好地保存了牛乳的營養(yǎng)與天然風味，因此在國內(nèi)外迅速發(fā)展，得到了消費者的認可[4-5]。但由于殺菌溫度較低，冷鏈溫度并不能總保持在推薦范圍內(nèi)，特別是在家用冰箱中，這增加了食品在貯存過程中發(fā)生變質(zhì)和出現(xiàn)潛在致病性微生物生長的風險[6-7]。因而不能殺死鮮乳中全部的微生物和酶，仍有部分孢子形成菌和耐熱細菌可能在這種環(huán)境下存活[8-9]。已有研究表明，巴氏殺菌乳貨架期都是單純依靠純培養(yǎng)技術判斷，此種方法僅能獲得實際檢測樣本中不到1%的微生物[10]，而絕大多數(shù)微生物過去都由于技術原因被忽略，由此可見當前普遍采用的依靠純培養(yǎng)技術獲得的乳制品貯藏條件和貨架期等參數(shù)可能不準確。同時，由于這些方法耗時且勞動密集，可能無法提供微生物群落多樣性的真實圖景。

近年來，隨著高通量測序技術的迅速發(fā)展，高通量測序技術早以應用到各個領域，包括土壤[11]、海洋[12]和腸道環(huán)境[13-14]。通過使用高通量測序技術，之前與牛奶沒有關聯(lián)的細菌屬，如擬桿菌、糞桿菌，現(xiàn)已經(jīng)能夠在牛奶中被檢測到[15]。張哲等[16]應用Pacbio SMRT測序技術分析傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中細菌和真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)有子囊菌門、硬壁菌門的出現(xiàn)。此外，Watanabe等[17]的研究結果也有類似的結果。其他研究[18]也利用高通量測序技術對當?shù)氐膬杉夷膛雠Ｄ虡悠返奈⑸锝M成進行了表征，通過對季節(jié)性的研究，發(fā)現(xiàn)冬季有假單胞菌屬、鏈球菌屬和不動桿菌屬的產(chǎn)生。由此可見，高通量測序技術的應用對乳制品中的微生物多樣性提供一個更加全面的分析[19-20]，使乳制品微生物方面的研究實現(xiàn)了一次歷史性的跨越。

因此，本研究對不同貯藏條件下巴氏殺菌乳中的微生物組成進行表征，利用宏基因組學技術方法對不同貯藏條件的巴氏殺菌乳樣品中殘留的耐熱微生物種類和動態(tài)變化規(guī)律進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集國內(nèi)大型3 家乳品企業(yè)（GZ、CG、HS）正常工藝當天生產(chǎn)的巴氏殺菌乳，各家66 份，共198 份成品，分別置于0、4、10 ℃的恒溫箱中保存，運回實驗室進行實驗。

DNA提取試劑盒、引物、配制聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系中的脫氧核糖核苷三磷酸、10×PCR buffer、r-Taq酶、Loading buffer、Marker DM2000、Gel-red核酸染料 上海美吉生物有限公司。

1.2 儀器與設備

Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)美國伯樂公司；ZHJH-C1112C無菌操作臺 北京瑞爾欣德科技有限公司；YCD-EL259醫(yī)用冷藏冷凍箱中科美菱低溫科技股份有限公司；HN-50S電熱恒溫培養(yǎng)箱 邦西儀器科技（上海）有限公司；MIR-254-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本松下健康醫(yī)療器械公司；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；TGL-168高速臺式離心機、超低溫冰箱、微量紫外-分光光度計德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及前處理

GZ乳業(yè)的工藝條件：原奶驗收→凈乳→預巴殺→冷藏→定容檢驗→預熱均質(zhì)→巴氏殺菌→冷藏罐裝→成品。

CG乳業(yè)的工藝條件：原奶驗收→凈乳→均質(zhì)→巴氏殺菌→降溫罐裝→成品。

HS乳業(yè)的工藝條件：原料乳的驗收→過濾與凈化→標準化→均質(zhì)→巴氏殺菌→冷卻灌裝→成品。

將采集的3 家巴氏殺菌乳混合均勻，分別置于0、4、10 ℃三種不同溫度的恒溫箱中進行貯藏，并分別于0、3、6、9、12、15 d進行取樣，備用。

1.3.2 總DNA的提取與檢測

取不同貯藏條件下的巴氏殺菌乳樣品10 mL放入離心管中，離心后去除乳脂層，再次離心后收集沉淀用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）充分洗滌，并移入干凈的離心管中，按照Soil Pure超純土壤基因組DNA試劑盒要求進行操作，完成巴氏殺菌乳樣品中細菌DNA的提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA，最后將DNA溶液于-20 ℃條件下保存，以備后續(xù)操作。

1.3.3 16S rRNA PCR擴增及熒光定量電泳檢測

本研究選擇的擴增區(qū)域是細菌16S rRNA的V3-V4區(qū)，利用已提取的DNA作為模板，選擇特異性引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL 5×FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。將每個樣本擴增3 份，同一樣本的PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢驗其PCR擴增是否成功。再參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用Q uanti FluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合，將PCR產(chǎn)物送于上海美吉生物科技有限公司進行測序。

1.3.4 MiSeq文庫的構建及測序

首先通過PCR將Illumin官方接頭序列添加到目標區(qū)域的外端，按物質(zhì)的量比例混合后在MiSeq測序平臺進行測序。使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）軟件去除低質(zhì)量序列，再進行生物信息學分析。在97%的相似性水平上歸類和確定可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)量，同時通過Shannon指數(shù)曲線評估每個樣品的微生物多樣性和測序結果的多樣性。

2 結果與分析

2.1 不同條件巴氏殺菌乳中細菌PCR擴增結果

圖1 不同條件巴氏殺菌乳中細菌16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 PCR amplification results of bacterial 16S rRNA genes from pasteurized milk samples at different storage temperatures for different times

將樣品DNA提取后，采用細菌338F-806R通用引物對濃度、吸光度均適宜的DNA樣品進行PCR擴增。擴增結果經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，由圖1可知，16 份樣品細菌在750 bp處可見擴增條帶清晰明顯，完整性較好，且無拖尾、彌散現(xiàn)象，這表明細菌的16S rRNA基因擴增成功。

2.2 不同條件巴氏殺菌乳中微生物多樣性分析

2.2.1 序列豐度分析

在97%的相似水平上進行OTU序列分類，巴氏殺菌乳中總共聚成1 887 個OTU。依據(jù)劃分的OTU，統(tǒng)計的序列數(shù)見表1，獲得的多樣性指數(shù)見圖2。細菌OTU數(shù)量隨著貯藏時間的延長而下降，在12 d后細菌種類有所增加。4、10 ℃條件下，細菌OTU數(shù)量下降速度較塊，0 ℃下降較緩慢。由此可見，巴氏殺菌乳在0 ℃貯藏微生物多樣性的變化較小，品質(zhì)較為穩(wěn)定。

表1 不同條件巴氏殺菌乳的序列數(shù)Table 1 Sequence number of pasteurized milk at different storage temperatures for different times

圖2 不同條件巴氏殺菌乳的多樣性指數(shù)Fig. 2 Diversity index of pasteurized milk at different storage temperatures for different times

圖3 不同樣品組巴氏殺菌乳的樣本層級聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of pasteurized milk samples in different groups

由圖3可知，對不同貯藏條件的巴氏殺菌乳進行微生物層級聚類分析，發(fā)現(xiàn)其聚集程度各不相同。在0 ℃貯藏0～15 d內(nèi)，巴氏殺菌乳的樣本OTU層級聚類在一起，變化不明顯，無明顯差異。而在4 ℃貯藏3、6、9 d時，樣本OTU層級與10 ℃貯藏不同時間條件下存在明顯的交叉聚類情況，這種現(xiàn)象發(fā)生在3、6 d時較為明顯。因此，猜測在4、10 ℃分別貯藏3、6 d時可能會影響微生物多樣性發(fā)生一定的變化，值得進一步探討和分析。

圖4 不同貯藏溫度、時間下巴氏殺菌乳的Shannon曲線Fig. 4 Shannon curves of pasteurized milk at different storage temperatures for different times

從圖4可以看出，在低測序量時，Shannon多樣性隨著測序量的增加而增加；而且當測序深度達到200～300左右時，樣品的Shannon多樣性曲線趨勢增長呈現(xiàn)緩慢趨勢，接近水平狀態(tài)，說明當前的測序量已經(jīng)能夠揭示出樣品中的微生物組成。

2.2.2 巴氏殺菌乳門水平上細菌群落多樣性分析

根據(jù)不同的貯藏溫度和貯藏時間，從巴氏殺菌乳樣品中共鑒定出7 個細菌門，分別為暫定螺旋菌門（Saccharibacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、柔壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、未分類菌群（others）。相對豐度較高且樣品均有分布的主要門類群有變形菌門、厚壁菌門。

圖5 不同條件巴氏殺菌乳門水平細菌群落組成分析Fig. 5 Analysis of bacterial community composition at the phylum level in pasteurized milk at various storage temperatures for different times

不同的貯藏溫度之間巴氏殺菌乳中細菌微生物菌群明顯不同（圖5），其中0 ℃貯藏的巴氏殺菌乳在門水平上細菌群落多樣性較為豐富，幾乎7 種細菌門皆有提及。隨著貯藏時間的延長也可看出其各菌門的豐度有著明顯波動，但并無明顯變化。證明在0 ℃貯藏的巴氏殺菌乳在0～15 d內(nèi)其門水平多樣性無明顯變化，此時貯藏較為穩(wěn)定。4 ℃貯藏3 d時可看出暫定螺旋菌門消失，菌門的豐富度顯著下降。在4、10 ℃貯藏6 d之后，在巴氏殺菌乳中，只剩下變形菌門、厚壁菌門兩類門水平微生物，并以變形菌門為此時的主要優(yōu)勢菌群。

根據(jù)主成分分析以及巴氏殺菌乳門水平細菌群落組成的分析，發(fā)現(xiàn)0 ℃貯藏0～15 d內(nèi)巴氏殺菌乳的微生物多樣性的變化不明顯，無明顯差異。4、10 ℃其微生物多樣性的變化有明顯差異。由此，將進一步對貯藏溫度0、4、10 ℃的巴氏殺菌乳細菌菌落屬水平進行分析，從菌屬的程度判斷和分析貯藏條件對巴氏殺菌乳的品質(zhì)影響。

2.2.3 巴氏殺菌乳屬水平上細菌群落多樣性分析

圖6 0 ℃貯藏巴氏殺菌乳屬水平細菌菌落分析Fig. 6 Analysis of bacterial community composition at the genus level in pasteurized milk stored at 0 ℃ for different times

如圖6所示，在0 ℃不同貯藏時間條件下，巴氏殺菌乳樣品中共鑒定出34 類細菌菌屬，分別為支原菌屬（Mycoplasma）、草酸桿菌屬（Oxalobacteraceae）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動細菌屬（Actinetobacter）、鏈球菌（Streptococcus）、Terrisporobacter、微球菌（Micrococcus）、Turicibacter、擬桿菌目S24-7組（norank_f_Bacteroidales_S24-7-group）、真細菌（[Eubacterium]_rectale_grou）、腸球菌（Enterococcus）、Peptoclostridium、Faecalibacterium、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、叢毛單胞菌科（unclassified_f_Comamonadaceae）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、疣微菌科UCG-005（Ruminococcaceae）、巨型球菌（Macrococcus）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、norank_p_Saccharibacteria、Paeniclostridium、Blautia、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、Peptostreptococcaceae、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、Clostriduium、嗜酸菌屬（Acidovorax）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、乳球菌屬（Lactococcus）、Solobacterium、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、Collinsella以及其他未分類菌屬等。隨著貯藏時間的延長可以看出支原菌屬先緩慢下降，而后又呈現(xiàn)上升狀態(tài)直到趨于穩(wěn)定。但從整體來看，0 ℃貯藏的巴氏殺菌乳在0～15 d內(nèi)其細菌菌落多樣性及各細菌屬豐度有明顯的波動，但并無明顯變化。

圖7 4 ℃貯藏巴氏殺菌乳屬水平細菌菌落分析Fig. 7 Analysis of bacterial community composition at the genus level in pasteurized milk stored at 4 ℃ for different times

與0 ℃巴氏殺菌乳細菌菌落種屬多樣性34 種（圖6）相比，4 ℃貯藏巴氏殺菌乳種屬多樣性（圖7）下降為21 種。大部分的菌屬都已消失，在貯藏3 d時其優(yōu)勢菌群也由支原菌屬、草酸桿菌屬變成了假單胞菌屬。同時此時還發(fā)現(xiàn)有新的菌屬氣單胞菌屬（Aeromonas）的產(chǎn)生，并且其在6 d后開始發(fā)生顯著的上升現(xiàn)象。隨后，在貯藏9 d時發(fā)現(xiàn)有類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）出現(xiàn)的情況，并在貯藏12 d以后，其類芽孢桿菌屬豐度顯著上升。根據(jù)之前研究的理化結果[21]，發(fā)現(xiàn)在此貯藏條件下的巴氏殺菌乳質(zhì)地逐漸變黏稠，這可能是發(fā)生了腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。由此，多樣性結果也進一步在此基礎上判斷出在3、 9 d有新的菌屬的產(chǎn)生，這可能是其品質(zhì)下降的關鍵點，推測假單胞菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬或許是導致巴氏殺菌乳品質(zhì)衰敗的關鍵因素。

圖8 10 ℃貯藏巴氏殺菌乳屬水平細菌菌落水平Fig. 8 Analysis of bacterial community composition at the genus level in pasteurized milk stored at 10 ℃ for different times

巴氏殺菌乳10 ℃貯藏3 d時細菌菌落屬水平上多樣性出現(xiàn)顯著下降現(xiàn)象（圖8），其變化與4 ℃貯藏大致相同（圖7）。貯藏3 d時假單胞菌屬豐度顯著上升，并在此后隨著貯藏時間的延長而下降，同時也發(fā)現(xiàn)了氣單胞菌屬的產(chǎn)生，其豐度在貯藏6 d開始大幅度上升。在貯藏9 d后也同樣發(fā)現(xiàn)了之前幾天未檢測出的芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬以及變形菌屬（unclassified_c_Gammaproteobacteria）的產(chǎn)生。結果表明，在10 ℃貯藏6 d時有新菌屬的產(chǎn)生，結合之前理化的研究結果[21]，推測此貯藏條件可能是影響品質(zhì)腐敗的關鍵裂變點此結果與4 ℃貯藏結果大致相同。故此，進一步推斷在貯藏期間新產(chǎn)生的假單胞菌屬、氣單胞菌屬、以及芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬可能是影響乳品發(fā)生腐敗變質(zhì)的潛在因素，今后也將在此基礎上進一步研究和探討，以此來證明實驗結果的完整性和準確性。

3 討 論

巴氏殺菌乳在我國的普及銷售是國際形式的大勢所趨，對巴氏殺菌乳貯藏條件的探索也是目前的主要研究方向[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在巴氏滅菌奶中存在潛在的腐壞微生物，這些微生物可能會在貯藏過程中影響產(chǎn)品質(zhì)量[23-24]。本研究利用宏基因組測序技術對不同貯藏條件下巴氏殺菌乳的微生物多樣性進行分析。研究表明，變形菌門、厚壁菌門這兩類門水平微生物是巴氏殺菌乳貯藏期間的主要優(yōu)勢菌群。但是隨著貯藏時間和溫度的延長及升高，巴氏殺菌乳中的細菌多樣性也在隨之改變。目前，我國的巴氏殺菌奶產(chǎn)品貨架期只有3～7 d。Elwell等[25]在2006年報道，商品巴氏殺菌奶在6 ℃的條件下可以貯藏16 d，而在0 ℃的條件下可以貯藏66 d。降低貯藏溫度主要是增加了細菌生長的遲滯期和延緩了細菌的對數(shù)生長期，此結論與陳慶華等[26]的研究結果相同，隨著貯存時間的延長微生物數(shù)量明顯增加。本研究在此基礎上還發(fā)現(xiàn)存在一些類芽孢菌屬以及沙雷氏菌屬，會導致乳品貯藏期間的腐敗變質(zhì)。研究結果表明，如若不能進行良好的貯藏，巴氏殺菌乳中殘留的嗜冷菌、嗜熱菌會導致乳品的腐敗變質(zhì)，進而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。

研究表明，耐熱性細菌及嗜冷菌的巴氏殺菌后污染是限制貨架期延長的主要原因[27]。大多數(shù)耐熱性細菌不能在冷藏條件下生長，芽孢桿菌和類芽孢桿菌的菌株被認為是限制牛奶保質(zhì)期常見的耐熱嗜冷菌[27]。芽孢菌屬在自然界中分布廣泛，與包括牛奶在內(nèi)的食品的污染和變質(zhì)有關[28]。這些細菌可能在牛奶運輸過程中以及在乳制品工廠通過加工設備而被污染[29]。芽孢桿菌形成內(nèi)生孢子的能力給乳制品行業(yè)帶來了挑戰(zhàn)，如果環(huán)境條件允許，孢子可能會萌發(fā)成增殖細菌[30]。因此，有必要對在不同貯藏溫度下存在的芽孢桿菌進行進一步的鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，芽孢桿菌屬的OTU數(shù)量明顯增加。相關研究也發(fā)現(xiàn)，巴氏滅菌后某些OTU的增加可能與梭菌目、芽孢桿菌目和乳酸菌目中的幾個熱成菌存活密切相關。同樣，其他研究[31-32]也證實牛奶樣品的成分差異也適用于芽孢桿菌屬。

嗜冷菌同樣也是影響原料乳及其制品質(zhì)量和安全的關鍵微生物。假單胞菌是對原料乳危害最大的嗜冷菌之一，極易在冷藏條件下成為優(yōu)勢菌群[33]。在冷藏溫度下，可能會增加假單胞菌和不動桿菌[12]的數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌乳在4、10 ℃條件下貯藏3 d時發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌群逐漸由支原菌屬、草酸桿菌屬變成了假單胞菌屬，與此同時還出現(xiàn)了氣單胞菌屬，在6 d以后顯著增加，這與貯藏的溫度密切相關。嗜冷菌在生長代謝過程中，分泌的耐熱性蛋白酶和脂酶，極易導致原料乳在高溫滅菌后發(fā)生凝膠、沉淀、變苦和酸敗現(xiàn)象[34]。由此可見，巴氏殺菌乳在不當?shù)馁A藏條件下會產(chǎn)生對人體致病的菌株。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在4、10 ℃貯藏9 d發(fā)現(xiàn)有沙雷氏菌菌株的出現(xiàn)，該細菌有能力在冷藏條件下生長，同樣也是導致牛奶發(fā)生變質(zhì)的主要原因。隨著基因和生物信息技術的進步，新型檢測方法對嗜冷菌在原料乳生產(chǎn)、貯藏和加工中的危害研究更加深入細致。開發(fā)快速、靈敏并能評估嗜冷菌以及胞外酶的危害性的檢測方法，仍然是需要解決的問題。

4 結 論

本研究利用宏基因組學高通量測序的方法對不同貯藏溫度下巴氏殺菌乳的多樣性指數(shù)和群落結構進行了分析研究，共檢測到7 個細菌門，34 類細菌菌屬。在0 ℃貯藏的巴氏殺菌乳微生物多樣性保持最完整；而4、10 ℃貯藏時是微生物多樣性顯著變化的關鍵點，對其巴氏殺菌乳的微生物多樣性及營養(yǎng)品質(zhì)都有著較大影響，菌群構成及優(yōu)勢菌群都發(fā)生了變化，貯藏溫度越高影響越大。同時，在4 ℃貯藏3、9 d，10 ℃貯藏6 d下巴氏殺菌乳品質(zhì)腐敗的關鍵時間點都出現(xiàn)了之前未被檢測出的類芽孢菌屬、沙雷氏菌屬，推測此兩種菌屬是導致巴氏殺菌乳品質(zhì)腐敗的關鍵決定因素。