利用壇紫菜藻紅蛋白制備脯氨酰內(nèi)肽酶抑制肽

謝雪瓊，鐘 嬋，孫樂(lè)常,2，翁 凌,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

脯氨酰內(nèi)肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）也稱脯氨酰寡肽酶，是一種能特異性水解低分子質(zhì)量多肽鏈（＜30 個(gè)氨基酸）羧基端脯氨酸殘基的細(xì)胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶。在哺乳動(dòng)物中，PEP參與組織中多種生理功能[1-2]，如學(xué)習(xí)和記憶、細(xì)胞分裂與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分泌，可降解Substance P、激素樣肽、神經(jīng)活性肽等[3-6]。當(dāng)PEP表達(dá)水平上調(diào)時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致一些神經(jīng)性疾病，如阿爾茲海默癥、健忘癥、抑郁癥和精神分裂癥的發(fā)生[7]。PEP三級(jí)結(jié)構(gòu)模型[8-9]顯示，其催化結(jié)構(gòu)域由α/β-折疊組合，其中C末端共價(jià)連接七葉-β-螺旋槳非催化域，兩區(qū)域界面的空腔形成該酶的活性位點(diǎn)。因?yàn)棣?螺旋槳結(jié)構(gòu)的存在，形成了PEP只能酶切小分子質(zhì)量多肽鏈的特點(diǎn)，也為PEP抑制劑（肽）的制備和設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。目前，普拉西坦、JTP-4819[10]、S-17092[11]和KYP-2047[12]等化學(xué)合成的PEP抑制藥物，在神經(jīng)保護(hù)和認(rèn)知增強(qiáng)方面均已表現(xiàn)良好的臨床治療效果[13]。由于化學(xué)合成藥物可能有不可預(yù)估的藥理副作用，近年來(lái)天然來(lái)源的PEP抑制肽受到關(guān)注。Sila等[14]發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶水解鲃屬魚(yú)（Barbus callensis）魚(yú)皮明膠產(chǎn)物可顯著抑制PEP的活性。Martinez-Alvarez等[15]發(fā)現(xiàn)，模擬胃、腸液消化后的沙丁魚(yú)和金槍魚(yú)肌肉蛋白水解液也具有PEP抑制效果。Hsieh等[16]從酪蛋白鈉酶解液中分離得到多種高活性的PEP抑制肽。Hellinger等[17]也從九尾屬的草藥中分離得到對(duì)人PEP具有抑制作用的植物源天然環(huán)肽。Manzanares等[18]發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白源PEP抑制肽PKH8和PKH11對(duì)PEP表現(xiàn)出抑制能力，而這種抑制還能消除神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中β淀粉樣肽的形成。以上研究均表明，動(dòng)物和植物源的生物活性肽是抑制PEP活性的潛在物質(zhì)。

壇紫菜（Porphyra haitanensis）是福建省特色優(yōu)勢(shì)海洋藻類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年福建省紫菜養(yǎng)殖面積1.7萬(wàn) 公頃，年產(chǎn)量達(dá)6.6萬(wàn) t[19]。紫菜含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、維生素和礦物質(zhì)等。藻膽蛋白是紅藻和藍(lán)藻特有的捕光色素蛋白，它包括藻紅蛋白（R-phycoerythrin，R-PE）、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白及藻紅藍(lán)蛋白4 種色素蛋白。紫菜中R-PE含量較高，最高可達(dá)干質(zhì)量的2.43%[20]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外以動(dòng)植物源蛋白為原料利用酶法制備生物活性肽的報(bào)道較多，特別是與高血壓相關(guān)的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽[21-26]。本課題組也利用胃、腸液蛋白酶對(duì)紅毛藻R-PE分解并分離制備了2 種血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽[27]。但紅毛藻原料價(jià)格昂貴，制備活性肽成本高。壇紫菜中R-PE含量豐富，且以壇紫菜為原料制備PEP抑制肽的研究還鮮有報(bào)道。此外，采用非胃、腸液蛋白酶制備的活性肽盡管在體外具有生物活性，但人體攝入經(jīng)胃、腸液進(jìn)一步消化后其活性會(huì)有所改變。因此，本研究擬以壇紫菜為研究對(duì)象，探討胃、腸液蛋白酶對(duì)其消化特性，分析消化產(chǎn)物的PEP抑制活性，并優(yōu)化制備PEP抑制肽的酶解條件，以期為壇紫菜高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干壇紫菜購(gòu)于廈門(mén)市集美區(qū)新華都超市。

DEAE-Sepharose陰離子交換層析樹(shù)脂 美國(guó)GE Healthcare公司；熒光底物succinylglcyl-L-proline 4-methylcoumaryl-7-amide（Suc-Gly-Pro-MCA） 日本Peptide Institute公司；豬胃蛋白酶、豬胰凝乳蛋白酶美國(guó)Sigma-Aldrich公司；豬胰蛋白酶 上海麥克林生化科技有限公司（中國(guó)）；高純度豬腦PEP 本實(shí)驗(yàn)室制備；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國(guó)Fermentas公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Lamda 35紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；FP-6200熒光分光光度計(jì) 日本Jasco公司；凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司；ND-100微量蛋白核酸測(cè)定儀 德國(guó)NanoDrop公司；Starter 3100 pH計(jì) 美國(guó)Ohaus公司；AKTA Basic UPC 10蛋白質(zhì)及多肽純化裝置 美國(guó)GE Healthcare公司；1260VL高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；恒溫水浴鍋 德國(guó)Memmert公司；蛋白質(zhì)電泳裝置 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 壇紫菜模擬胃、腸液消化

模擬胃、腸液消化實(shí)驗(yàn)?zāi)M胃、腸液配制參考美國(guó)藥典[28]的方法。胃液配制：1 L模擬胃液中含2 g氯化鈉，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH 1.2；腸液配制：1 L模擬腸液中含6.8 g磷酸二氫鉀，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH 7.5。

壇紫菜體外模擬胃、腸液消化實(shí)驗(yàn)參照黃園園等[29]的方法，胃蛋白酶（≥250 U/mg）、混合酶（即胰蛋白酶（250 U/mg）和胰凝乳蛋白酶（≥40 U/mg）質(zhì)量比為1∶1）與壇紫菜粉末的比例為1∶50（m/m）。將20 g壇紫菜粉末與400 mL超純水混合后組織搗碎機(jī)勻漿10 min，然后將勻漿液稀釋50 倍后待用。模擬胃液消化：取已稀釋均漿液4 mL于15 mL離心管，在37 ℃恒溫水浴預(yù)熱10 min后，加入0.08 mg/mL胃蛋白酶1 mL，振蕩混勻，反應(yīng)60 min后立即加入300 μL 0.2 mol/L碳酸鈉溶液，調(diào)整pH 7.5，終止反應(yīng)，該反應(yīng)液為模擬胃液消化產(chǎn)物；模擬腸液消化：模擬胃液消化產(chǎn)物，繼續(xù)加入1 mL含混合酶（0.08 mg/mL）的模擬腸液，37 ℃反應(yīng)120 min后，在95 ℃加熱5 min使混合酶失活，終止反應(yīng)。測(cè)定壇紫菜模擬胃、腸液消化產(chǎn)物的PEP抑制活性。

1.3.2 R-PE的分離純化

壇紫菜R-PE的分離純化參考付曉蘋(píng)[30]的方法。壇紫菜與蒸餾水按1∶20（g/mL）比例混合，經(jīng)反復(fù)凍融、組織勻漿等處理以充分破碎細(xì)胞，制成壇紫菜R-PE粗提液。離心后取上清液，進(jìn)行35%～50%硫酸銨鹽析，沉淀復(fù)溶于20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.6），并用相同緩沖液透析，將透析后的樣品上樣于預(yù)先用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.6）平衡好的DEAE-Sepharose陰離子交換層析柱（2.5 cm×10 cm），上樣結(jié)束后用平衡緩沖液流洗層析柱直至洗脫液在波長(zhǎng)280 nm下的紫外吸光度低于0.05，再用20 mmol/L磷酸緩沖液（含0.05 mol/L氯化鈉，pH 5.6）和20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.2 mol/L氯化鈉）進(jìn)行線性洗脫。

純化樣品冷凍干燥后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩＠肨ricine-SDS-PAGE[30]和吸光度A565nm/A280nm分析樣品純度，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)純化的樣品進(jìn)行光吸收值掃描分析紫外-可見(jiàn)光吸收光譜特性。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

純化過(guò)程中，使用微量蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定樣品在280 nm的吸光度；純化的R-PE使用Bradford法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.4 酶法制備PEP抑制肽的條件優(yōu)化

利用主要消化酶（胃蛋白酶和混合酶）分步酶解純化的R-PE制備PEP抑制肽。在模擬胃、腸液消化的基礎(chǔ)上，分析不同含量蛋白酶和酶解時(shí)間對(duì)PEP抑制活性的影響。

第1階段酶解，選取胃蛋白酶和純化的R-PE（1 mg/mL）比例（m/m）為：0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%，在37 ℃對(duì)R-PE酶解60 min，測(cè)定不同水解液的PEP抑制活性，確定最適的胃蛋白酶添加量。在最適胃蛋白酶添加量下對(duì)R-PE酶解0、1、2、5、10、15、30、60 min，測(cè)定不同水解液的PEP抑制活性，以確定最佳的胃蛋白酶酶解時(shí)間。

利用以上優(yōu)化的條件對(duì)R-PE（1 mg/mL）進(jìn)行酶解，將水解產(chǎn)物進(jìn)行第2階段酶解，選取混合酶和純化的R-PE（1 mg/mL）比例（m/m）為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%，在37 ℃恒溫反應(yīng)120 min，測(cè)定不同水解液的PEP抑制活性，確定最適的混合酶添加量。之后，再做進(jìn)一步探究，以確定混合酶的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 PEP抑制活性測(cè)定

參考Hellinger等[17]方法略作修改。具體方法如下：將100 μL質(zhì)量濃度為40 μg/mL的PEP（28.7 U/mg）置于750 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液（含4 mmol/L β-巰基乙醇，pH 6.0）中，加入100 μL R-PE水解液，30 ℃恒溫反應(yīng)15 min。加入50 μL濃度為10 μmol/L的熒光底物Suc-Gly-Pro-MCA，充分混勻，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min后，用1.5 mL終止液（甲醇-異丙醇-超純水（35∶30∶35，V/V））終止反應(yīng)。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)熒光底物釋放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強(qiáng)度，測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為380 nm和450 nm。對(duì)照組以100 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液替換R-PE水解液。

式中：A為實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度；B為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

R-PE水解液的IC50測(cè)定參考Hsieh等[16]方法，并略作修改。根據(jù)以上方法，測(cè)定不同質(zhì)量濃度R-PE水解液的PEP抑制率。以不同質(zhì)量濃度R-PE水解液為橫坐標(biāo)和對(duì)應(yīng)PEP抑制率為縱坐標(biāo)作圖分析。

1.3.6 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGE分析

R-PE的水解效果采用Tricine-SDS-PAGE分析，主要參考Sch?gger[31]的方法。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠染色，之后，用脫色液脫色至蛋白條帶清晰，用凝膠記錄儀記錄結(jié)果。

1.3.7 R-PE水解液分子質(zhì)量分布比例測(cè)定

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法，參考伍強(qiáng)[27]的方法，略作修改。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品如下：魚(yú)小清蛋白II，11 950 Da；50肽（HDGKGLFYNSYPDQEG KSDGTETSTNLHQKLYYHVLGTPQSEDVLCAEFP），5 617.97 Da；桿菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。

色譜條件：GF-1260 Agilent HPLC，純化系統(tǒng)；色譜柱為T(mén)SK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣體積10 μL（標(biāo)準(zhǔn)品）和50 μL（待測(cè)樣品）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃。所得數(shù)據(jù)利用GPC Offline軟件進(jìn)行分析，確定樣品分子質(zhì)量的分布比例。

1.3.8 R-PE水解液對(duì)PEP的抑制類型及抑制常數(shù)分析

參考陳清西[32]的方法，并略作修改。

抑制類型分析：分別取100 μL不同質(zhì)量濃度PEP（0、5、10、20、30、40 μg/mL）置于750 μL、25 mmol/L磷酸緩沖液（含4 mmol/L β-巰基乙醇，pH 6.0）中，與100 μL不同質(zhì)量濃度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL）混合，再加入50 μL濃度為10 μmol/L的熒光底物Suc-Gly-Pro-MCA，充分混勻，在37 ℃恒溫水浴反應(yīng)5 min后，加入1.5 mL終止液終止反應(yīng)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)熒光底物釋放的AMC，由此計(jì)算反應(yīng)的初速率，以PEP質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率作圖，分析R-PE水解液對(duì)PEP的抑制類型。

抑制常數(shù)的測(cè)定：分別取100 μL 20 μg/mL PEP置于750 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液（含4 mmol/L β-巰基乙醇，pH 6.0）中，加入100 μL不同質(zhì)量濃度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL），再加入不同濃度熒光底物Suc-Gly-Pro-MCA（0、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L），充分混勻，在37 ℃恒溫水浴反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)。計(jì)算酶促反應(yīng)初速率，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算R-PE水解液對(duì)PEP的抑制常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究有關(guān)PEP抑制數(shù)據(jù)處理中，以同一組內(nèi)3 個(gè)重復(fù)樣品的平均變異系數(shù)為組內(nèi)誤差進(jìn)行分析。利用SPSS Statistics 17.0計(jì)算機(jī)程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜模擬胃、腸液消化

壇紫菜經(jīng)體外模擬胃、腸液消化后，水解產(chǎn)物的PEP抑制活性結(jié)果如圖1所示。消化60 min后，產(chǎn)物中PEP抑制活性顯著提高；繼續(xù)經(jīng)模擬腸液消化120 min后，終產(chǎn)物的PEP抑制活性沒(méi)有明顯變化。由此可知，壇紫菜中的蛋白質(zhì)是PEP抑制活性肽的潛在資源，且胃、腸液，特別是胃液消化有助于提高其對(duì)PEP的抑制活性。

圖1 壇紫菜模擬胃、腸液消化產(chǎn)物的PEP抑制活性Fig. 1 PEP inhibitory activity of P. haitanensis hydrolysates from simulated gastrointestinal digestion

2.2 R-PE的分離純化

由表1可知，壇紫菜經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，分離得到R-PE，純化倍數(shù)為6.0 倍，得率達(dá)17.0%。該R-PE純度系數(shù)（A565nm/A280nm=5.4）較紅毛藻源R-PE（A565nm/A280nm=5.1）高[27]，達(dá)到試劑級(jí)（＞4.0）[33]，但其得率較紅毛藻源R-PE（43.4%）低。對(duì)純化R-PE進(jìn)行紫外光譜特性和Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。其中，紫外-可見(jiàn)吸收光譜特性（圖2a）與文獻(xiàn)報(bào)道的壇紫菜源R-PE在499 nm和565 nm波長(zhǎng)處均有最大特征吸收峰基本一致。Tricine-SDS-PAGE分析（圖2b）發(fā)現(xiàn)純化R-PE有3 個(gè)亞基α、β和γ，分子質(zhì)量分別為21、22、32 kDa，與付曉蘋(píng)[30]報(bào)道壇紫菜R-PE的SDS-PAGE結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，通過(guò)硫酸銨鹽析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等技術(shù)分離純化可得到高純度的R-PE。

表1 壇紫菜R-PE的純化結(jié)果Table 1 Summary of purification of R-PE from P. haitanensis

圖2 壇紫菜R-PE紫外-可見(jiàn)光吸收光譜圖（a）和Tricine-SDS-PAGE圖（b）Fig. 2 UV absorption spectrum (a) and Tricine-SDS-PAGE (b) of purified R-PE from P. haitanensi

2.3 酶法制備PEP抑制肽的條件確定

2.3.1 胃蛋白酶比例及消化時(shí)間的確定

圖3 第1階段酶解胃蛋白酶添加量（a）及酶解時(shí)間（b）對(duì)R-PE水解液PEP抑制活性的影響Fig. 3 Effect of pepsin dosage (a) and digestion duration (b) on the PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate

由圖3a可知，隨著胃蛋白酶比例增加，R-PE消化產(chǎn)物中PEP抑制活性明顯增加，當(dāng)胃蛋白酶和R-PE比例為0.5%（m/m）時(shí)，其水解產(chǎn)物中PEP抑制活性最強(qiáng)。但繼續(xù)增大加酶量，產(chǎn)物對(duì)PEP抑制活性不再增加，推測(cè)在該條件下R-PE中胃蛋白酶的酶切位點(diǎn)已被充分酶解，由此確定胃蛋白酶添加量為0.5%。

進(jìn)一步分析酶解時(shí)間對(duì)R-PE水解產(chǎn)物的PEP抑制活性影響，如圖3b所示，在30 min內(nèi)，R-PE水解產(chǎn)物的PEP抑制活性隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，且在酶解時(shí)間為30 min時(shí)R-PE水解產(chǎn)物中PEP抑制活性最強(qiáng)；繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，在30～60 min范圍，酶解時(shí)間對(duì)R-PE水解液中PEP抑制活性影響較小。由此可知，利用R-PE酶法制備PEP抑制肽的第1階段酶解條件為：胃蛋白酶與R-PE比例0.5%（m/m）、酶解時(shí)間30 min，pH 1.2，溫度37 ℃。

2.3.2 混合酶比例及消化時(shí)間的確定

圖4 混合酶添加量（a）及酶解時(shí)間（b）對(duì)R-PE水解液PEP抑制活性的影響Fig. 4 Effect of T + C dosage (a) and digestion duration (b) on the PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate

利用2.3.1節(jié)優(yōu)化的酶解條件對(duì)R-PE進(jìn)行第1階段酶解后將水解產(chǎn)物進(jìn)行第2階段酶解，不同比例混合酶對(duì)消化產(chǎn)物中PEP抑制活性的影響如圖4a所示，混合酶與R-PE比例為0.25%（m/m）時(shí)，終產(chǎn)物的PEP抑制活性最強(qiáng)，繼續(xù)增大加酶量的水解產(chǎn)物對(duì)PEP抑制活性反而有下降趨勢(shì)，推測(cè)模擬胃液消化產(chǎn)生的某些活性肽被混合酶過(guò)度降解可失去PEP抑制活性。

在R-PE中加入0.5%胃蛋白酶，酶解30 min后進(jìn)行第2階段酶解，混合酶添加量為0.25%，研究酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的PEP抑制活性影響，如圖4b所示，當(dāng)連續(xù)酶解至60 min時(shí)，終產(chǎn)物的PEP抑制活性最強(qiáng)。由此可知，利用R-PE酶法制備PEP抑制肽的第2階段酶解條件為混合酶與R-PE比例0.25%（m/m）、酶解時(shí)間30 min、pH 7.5、溫度37 ℃。

2.4 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGE分析

圖5 R-PE水解液的Tricine-SDS-PAGEFig. 5 Tricine-SDS-PAGE pattern of R-PE hydrolysate

如圖5所示，與酶解前的蛋白（泳道C）相比，胃蛋白酶和混合酶對(duì)R-PE均有明顯的消化作用。在胃蛋白酶酶解5 min后，R-PE的α亞基、β亞基、γ亞基發(fā)生顯著的降解；酶解5～30 min范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物被胃蛋白酶繼續(xù)降解；之后，進(jìn)行第2階段酶解，在30～60 min范圍進(jìn)一步被降解為更小分子的產(chǎn)物，而在90～150 min范圍，酶解變化不明顯，與圖4b 60～150 min的水解產(chǎn)物PEP抑制活性差異不顯著結(jié)果一致。

2.5 R-PE水解液的分子質(zhì)量分布

表2 R-PE酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布及所占比例Table 2 Molecular mass distribution of R-PE hydrolysate

如表2所示，由GPC軟件分析可知，R-PE在酶解過(guò)程中，酶解產(chǎn)物的蛋白分子質(zhì)量變化是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程。R-PE是由分子質(zhì)量分別為21、22、32 kDa的3 個(gè)亞基α、β和γ組成的蛋白質(zhì)，第1階段酶解后，65.94%酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量小于3 kDa；繼續(xù)酶解，到第2階段水解完畢，分子質(zhì)量低于3 kDa的酶解產(chǎn)物的比例增至86.06%，分子質(zhì)量高于5 kDa的酶解產(chǎn)物的比例由24.30%降至4.52%。R-PE酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布色譜圖如圖6所示，比較圖6a與圖6b，經(jīng)過(guò)第1階段胃蛋白酶酶解的R-PE，在第2階段經(jīng)混合酶得到進(jìn)一步水解，特別是對(duì)分子質(zhì)量大于5 kDa產(chǎn)物的酶解作用效果顯著。由此知，經(jīng)過(guò)兩步酶解的R-PE幾乎被完全水解，表明利用胃蛋白酶、混合酶對(duì)R-PE進(jìn)行分步酶解，可制備出低分子質(zhì)量、較高活性的R-PE源PEP抑制肽。

圖6 胃蛋白酶（a）和混合酶（b）R-PE酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Fig. 6 Molecular mass distribution of peptide fractions from R-PE hydrolysate

2.6 R-PE水解液的PEP抑制活性

圖7 不同質(zhì)量濃度R-PE水解液的PEP抑制活性Fig. 7 PEP inhibitory activity of R-PE hydrolysate at different concentrations

根據(jù)PEP抑制活性的檢測(cè)方法，將R-PE水解液稀釋為不同濃度，分別測(cè)定對(duì)PEP的抑制率。以不同質(zhì)量濃度R-PE水解液（31.25～666.67 μg/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的PEP抑制率（13.59%～88.40%）為縱坐標(biāo)作圖分析，結(jié)果如圖7所示。R-PE水解液的PEP抑制活性IC50為136.35 μg/mL，低于其他動(dòng)物來(lái)源的PEP抑制肽的IC50，如沙丁魚(yú)魚(yú)頭水解液IC50（9 570±1 480）μg/mL[15]、金槍魚(yú)魚(yú)頭水解液IC50（3 300±1 050）μg/mL[15]、酪蛋白鈉水解產(chǎn)物IC50（770 μg/mL）[16]、乳鐵蛋白源PEP抑制肽PKH11的IC50（2 100±200）μg/mL[18]。因此，經(jīng)胃蛋白酶和混合酶酶解的R-PE水解產(chǎn)物具有更顯著的PEP抑制活性。

2.7 R-PE水解液對(duì)PEP的抑制類型及抑制常數(shù)分析

圖8 R-PE水解液對(duì)PEP的抑制動(dòng)力學(xué)Fig. 8 Kinetic study on inhibition of R-PE hydrolysate on PEP

圖8 A顯示不同質(zhì)量濃度R-PE水解液（0、0.025、0.05、0.1 mg/mL）作用PEP的抑制動(dòng)力學(xué)曲線均為通過(guò)原點(diǎn)的直線，可知R-PE水解液對(duì)PEP的抑制作用是可逆過(guò)程。如圖8B所示，不同質(zhì)量濃度R-PE水解液存在時(shí)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線相交于X軸，說(shuō)明R-PE水解液對(duì)PEP表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。進(jìn)一步運(yùn)用二次作圖法，以雙倒數(shù)圖的斜率對(duì)R-PE水解液質(zhì)量濃度作圖，從橫軸截距可求出其抑制常數(shù)Ki為14 μg/mL。與從酪蛋白鈉酶解液中分離得到9 種PEP抑制肽[20]的競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型不同，R-PE水解液對(duì)PEP的抑制屬于可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，說(shuō)明R-PE水解液中PEP抑制肽沒(méi)有與PEP酶催化區(qū)域結(jié)合而是作用于其他位點(diǎn)，形成中間復(fù)合體從而抑制PEP的活性。

3 結(jié) 論

本研究以福建高產(chǎn)的壇紫菜為原料，利用硫酸銨鹽析和離子交換技術(shù)獲得高純度藻紅蛋白，為對(duì)該蛋白的食品學(xué)功能分析創(chuàng)造了條件。利用胃、腸液消化酶分步酶解壇紫菜R-PE，并優(yōu)化酶解條件獲得PEP抑制肽的制備工藝。采用Tricine-SDS-PAGE驗(yàn)證酶解效果，凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)得R-PE水解液中分子質(zhì)量在3 kDa以下的小肽含量為86.06%。制備的R-PE酶解液通過(guò)可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式對(duì)PEP表現(xiàn)較高的抑制活性，其IC50為136.35 μg/mL。紫菜中含量豐富的R-PE是潛在的PEP抑制活性肽來(lái)源，今后有必要對(duì)PEP抑制肽進(jìn)行分離純化并解明它們的結(jié)構(gòu)。本研究為壇紫菜作為功能性食品的高值化利用提供了理論參考。