李雨濛，馬佳康，任凱凱，李 南，王 健，孫金旗，張亞麗，馬 軍

0 引 言

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于第8位，占所有癌癥死亡率的第6位。中國食管癌病例占全球一半以上，每年約有15萬人死于這一疾病，是我國癌癥相關(guān)死亡的第4大病因。食管癌在組織病理學(xué)和流行病學(xué)上存在較大程度的差異。食管癌主要有食管鱗癌和食管腺癌2個亞型，我國食管鱗癌的發(fā)病率達(dá)90%以上，而西方國家以食管腺癌為主［1］。食管鱗癌主要發(fā)生在食管上段和中段，與吸煙和酗酒關(guān)系密切；食管腺癌主要發(fā)生在和胃相連的食管下部，與肥胖、胃反流和Barrett食管有關(guān)［2］。食管腺癌的男女發(fā)病率亞洲地區(qū)為4∶1，北美地區(qū)達(dá)8∶1；食管鱗癌全球發(fā)病率男女比為2.7∶1，從西亞地區(qū)的1.2∶1到東歐的7.8∶1有較大的變化［3］。但食管鱗癌和食管腺癌在分組特征方面有多大的差異目前并不明確。本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌、食管腺癌的差異基因，構(gòu)建了相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，篩選出了一批生存相關(guān)的lncRNA、miRNA及mRNA。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)下載及差異基因篩選從TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載食管鱗癌、腺癌的mRNA、lncRNA、miRNA測序數(shù)據(jù)及臨床信息。截止2018年10月10日，數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌mRNA及l(fā)ncRNA測序數(shù)據(jù)92例，其中81例食管鱗癌組織樣本及11例癌旁正常組織樣本，miRNA食管鱗癌測序數(shù)據(jù)108例，包括食管鱗癌組織樣本95例，癌旁正常組織樣本13例；食管腺癌mRNA及l(fā)ncRNA測序數(shù)據(jù)91例，其中80例食管腺癌組織樣本及11例癌旁正常組織樣本，miRNA食管腺癌測序數(shù)據(jù)102例，包括食管腺癌組織樣本89例、癌旁正常組織樣本13例。使用R語言“edgeR”包篩選差異基因，篩選條件為：log 2-fold change（logFC）＞2且P＜0.05。

1.2 食管鱗癌和食管腺癌的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出的差異mRNA、lncRNA、差異miRNA在miRcode數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行配對。利用starBase在線軟件（http：//starbase.sysu.edu.cn/）對篩選出的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，miRDB、miRTarBase、TargetScan3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因，從而得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape v3.5.1軟件進(jìn)行作圖。

1.3 miRNA靶基因預(yù)測及GO、KEGG功能富集分析利用在線數(shù)據(jù)庫miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）預(yù)測miRNA調(diào)控的靶基因。人類miRNA識別靶基因的seed區(qū)域比較短，預(yù)測到的靶基因較多，預(yù)測結(jié)果在targetscan，miRDB等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。GO、KEGG使用Cytoscape 中的“ClueGO”、“CluePedia”軟件包完成，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4 利用生存分析尋找和生存相關(guān)的差異基因利用TCGA數(shù)據(jù)庫中所有食管癌的生存時間，采用的是R語言中的“Survival”包，對差異的lncRNA、miRNA、mRNA進(jìn)行生存分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌和腺癌差異基因篩選及ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建TCGA數(shù)據(jù)庫中食管鱗癌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，共篩選出差異lncRNA1160個、mRNA 2064個、miRNA 69個；腺癌共篩選出差異lncRNA 709個、mRNA 1490個、miRNA 81個。食管鱗癌中，73個lncRNA、9個miRNA及13個mRNA參與構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)；食管腺癌中，51個lncRNA、10個miRNA及14個mRNA參與構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)。食管鱗癌和食管腺癌的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示：PVT1、LINC00524、miR-204、miR-383、HOXC8、NTRK2等在食管鱗癌和腺癌中均起重要調(diào)控作用。見圖1。

2.2 miR-204靶基因預(yù)測及GO、KEGG功能分析miR-204-5p經(jīng)miRWalk共預(yù)測到13227個調(diào)控靶基因，在targetscan，miRDB數(shù)據(jù)庫共篩選出232個靶基因。GO功能分析顯示38個富集，主要參與：細(xì)胞-基質(zhì)黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜投射形態(tài)發(fā)生、β-連環(huán)蛋白結(jié)合等過程。KEGG分析顯示4個相關(guān)通路：Hedgehog信號通路、壽命調(diào)節(jié)通路、雌激素信號通路、松弛素信號通路。見圖2。

2.3 食管鱗癌和腺癌ceRNA中差異基因生存分析食管鱗癌和腺癌相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異基因生存分析結(jié)果顯示，食管鱗癌中與患者生存相關(guān)的 差 異 lncRNA 包 括 LINC00261、MLIP-IT1、LINC00504，差異miRNA包括hsa-mir-338，未發(fā)現(xiàn)與生存相關(guān)的mRNA。食管腺癌中與生存相關(guān)的差異lncRNA包括CYP1B1-AS1、HOTAIR，差異mRNA包括IL11、NTRK2、ANGPT2、PBK，未發(fā)現(xiàn)與生存相關(guān)的miRNA。

2.4 食管鱗癌和腺癌共有差異基因分析食管鱗癌和腺癌共有的差異lncRNA上調(diào)占15.4%（150個），下調(diào)占26.8%（158個）；miRNA上調(diào)占24.2%（22個），下調(diào)占27.6%（8個）；mRNA上調(diào)占20.5%（234個），下調(diào)占23.7%（418個）。食管鱗癌和腺癌中對上述共有差異基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示與食管鱗癌和腺癌生存均相關(guān)的lncRNA為AL138789.1；miRNA為hsamir-105-2、hsa-mir-105-1、hsa-mir-767；mRNA 為KIF18A、PBK、GPER1，見圖3。

圖1 食管鱗癌及腺癌相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Competitive endogenous RNA（ceRNA）networks for ESCC（a）and EAC（b）

圖2miR-204靶基因GO及KEGG功能分析Figure 2 GO analysis of the functional enrichments（a）and KEGG analysis of the signaling pathways（b）of the miR-204 target gene

圖3 食管鱗癌和腺癌共有差異表達(dá)基因生存分析圖Figure 3 Venn diagram and Kaplan-Meier survival curves for differentially expressed genes in both ESCC and EAC

3 討 論

EAC和ESCC存在著明顯的流行病學(xué)和組織病理學(xué)差異，預(yù)示著EAC和ESCC可能存在明顯的差異，但ESCC與EAC在分子特征方面的差異目前并不明確。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫ESCC及EAC測序數(shù)據(jù)中篩選出差異RNA，并成功構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這可能對研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機制提供新的方法。

ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了一些在ESCC和EAC均起重要調(diào)控作用的基因。Li PD等研究表明PVT1作為miR-203和LASP1的分子海綿可以促進(jìn)ESCC的進(jìn)展［6］。一項關(guān)于食管癌的研究表明：miR-204可以促進(jìn)Sox4的降解，但這一作用可以被lncRNA UCA1所抑制進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖［7］。miR-204靶基因的GO、KEGG分析也表明其可能參與ESCC及EAC的形成與進(jìn)展。對ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異基因進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析篩選出了一批與ESCC及EAC生存相關(guān)的差異基因。其中，LINC00261和miR-338已被證實參與ESCC的形成與進(jìn)展［8-9］，本研究分析結(jié)果與其相同且發(fā)現(xiàn)它們與患者的預(yù)后相關(guān)。既往研究表明HOTAIR、PBK、NTRK2與ESCC相關(guān)，本研究中發(fā)現(xiàn)它們也可能參與EAC的發(fā)生、發(fā)展并且與患者預(yù)后相關(guān)［10-12］?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)了一些與ESCC、EAC患者生存相關(guān)的差異基因，可能作為食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)ESCC和EAC在分子特征方面存在差異。為了尋找與ESCC和EAC生存均相關(guān)的差異基因，本研究將分別將ESCC和EAC中的這些差異基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：AL138789.1、hsa-mir-105-2、hsa-mir-105-1、hsa-mir-767、KIF18A、PBK、GPER1與ESCC和EAC患者預(yù)后均相關(guān)，除GPER1在ESCC和EAC中的生存趨勢一致，其余差異基因在ESCC和EAC中的生存趨勢則相反。GPER1作為膜性雌激素受體的一種，介導(dǎo)了雌激素靶器官癌癥的發(fā)生發(fā)展，尤其是在乳腺癌中可以與雌激素和表皮生長因子相互作用使雌激素具有表皮生長因子的作用［13］，同時使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥［14］。本研究分析結(jié)果顯示該基因在ESCC和EAC腫瘤組織中表達(dá)均降低，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)，可以作為食管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌中，miR-105-1表達(dá)量降低且與高表達(dá)患者相比生存期明顯縮短［15-16］。ESCC的生存分析與其一致，高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)者更長；但在EAC患者中的生存趨勢相反。KIFl8A作為驅(qū)動蛋白家族的成員之一，其在維持微管動態(tài)和參與細(xì)胞有絲分裂中扮演著重要的角色。研究表明，KIF18A在肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌中表達(dá)增高，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲方面發(fā)揮著重要作用［17-19］，但在胃癌中表達(dá)下調(diào)且與患者不良預(yù)后相關(guān)［20］。本研究分析結(jié)果顯示：KIF18A在ESCC和EAC中均增高，但在高表達(dá)的ESCC患者中預(yù)示著更長的生存時間，但在高表達(dá)的EAC中則相反。

總之，本研究分析表明ESCC和EAC可能存在著明顯的分子差異，篩選出的生存相關(guān)差異基因?qū)τ贓SCC和EAC患者預(yù)后的預(yù)測作用相反，我們將在今后的實驗中對具體的作用機制進(jìn)行探討。