王 僑 王睿瑞 李 東 王健英 張 磊 賀 光 季 光,4 劉保成△

1.上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)健康服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心 (上海， 201203) 2.上海市浦東新區(qū)張江社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心 3.上海交通大學Bio-X研究院 4.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脾胃病研究所

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的慢性肝臟疾病，以體內(nèi)大量脂肪堆積導致肝臟體積增加5%～10%并且無過量飲酒史 (男性≤30 g/d；女性≤20 g/d)的一種病理狀態(tài)[1, 2]。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝癌等[3]。中醫(yī)體質(zhì)學說認為，體質(zhì)是人體在先天遺傳的基礎(chǔ)上加上后天所得表現(xiàn)出的生理功能、心理健康和外部結(jié)構(gòu)各方面綜合的、比較穩(wěn)定的一種特質(zhì)。在某些特殊情況下，體質(zhì)決定著疾病的易感性[4]。在個人稟賦和外界環(huán)境的影響下, 不同個體有不同的癥狀表現(xiàn), 而相對穩(wěn)定的體質(zhì)便會成為研究某些疾病異質(zhì)性以及有效指導臨床的線索[5]。NAFLD 是受遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素影響的復雜疾病，其中與遺傳易感性關(guān)系密切。既往研究發(fā)現(xiàn)瘦素與單純性脂肪肝有關(guān)，其與瘦素受體(LEPR)結(jié)合, 在瘦素生物學作用的發(fā)揮中起重要作用[6]。脂聯(lián)素(ADIPOQ)是脂肪細胞分泌的活性蛋白之一，與糖、脂肪等代謝有著密切的關(guān)系，參與了腎臟疾病、肝臟疾病、胰島素抵抗等多種疾病發(fā)生、發(fā)展的機制[7,8]。既往研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者以痰濕質(zhì)居多[9,10]，因此，本研究將對NAFLD痰濕質(zhì)患者與LEPR基因以及ADIPOQ基因多態(tài)性進行關(guān)聯(lián)研究分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入人群為2018年4月至7月參與上海市浦東新區(qū)張江社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心常規(guī)體檢的常住居民。最終納入NAFLD患者461例，其中痰濕質(zhì)組207例(男∶女=118∶89)，非痰濕質(zhì)組254例(男∶女=101∶153)。每位參與者均測量了基礎(chǔ)指標(身高、體重、腰圍、臀圍和血壓等)以及生化指標(血常規(guī)、肝功能、腎功能、空腹血糖和血脂等)。本研究遵從上海中醫(yī)藥大學醫(yī)藥倫理委員會條例，每位參與者均簽訂知情同意書。

1.2 NAFLD診斷標準 NAFLD 的診斷標準采用中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組以及中國醫(yī)師協(xié)會脂肪性肝病專家委員會共同制訂的《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 年更新版)》中的臨床診斷標準[11]?；颊呔蓛擅哂兄屑壱陨下毞Q的操作熟練的超聲科醫(yī)師采用彩色多普勒超聲進行診斷。

1.3 納入及排除標準 納入標準：①參與體檢、中醫(yī)問卷填寫以及進行基因分型者；②B超診斷為NAFLD者；③同意參加本研究并簽署知情同意書者；④年齡>65歲者。排除標準：①未參與體質(zhì)問卷填寫者；②年齡<65歲者；③生化指標和體質(zhì)問卷信息不完整及明顯有誤者；④未進行基因多態(tài)性分型者；⑤患有嚴重心腦肺腎疾病、惡性腫瘤以及拒絕填寫知情同意書者。

1.4 中醫(yī)體質(zhì)診斷 體質(zhì)診斷采用中華中醫(yī)藥學會頒布的體質(zhì)分類法[12]。量表分為9個部分，由平和質(zhì)和8種偏頗體質(zhì)(陰虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、氣虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)和特稟質(zhì))9個自評亞量表組成，共33道問題。每位調(diào)查員在問卷填寫之前經(jīng)過統(tǒng)一化、規(guī)范化的填寫標準培訓并通過考核，調(diào)查時盡量做到術(shù)語表述一致，填寫時采取面對面的方式。為保證問卷信息的準確性，采用雙人雙錄入的方式。在每個體質(zhì)得分的基礎(chǔ)上利用判別分析法判定每種體質(zhì)[13]。

1.5 基因檢測方法 選用LEPR rs1805094、 rs11208659、 rs4655537、 rs12409877和ADIPOQ rs182052、 rs3774261、 rs6773957、 rs17366568這8個位點進行基因多態(tài)性分析。所有研究對象抽血前空腹10 h，于次日上午采外周靜脈血樣。采用苯酚-氯仿法進行基因組DNA提??；采用Sequenom 平臺的MassARRAY?分子量陣列技術(shù)對ADIPOQ和LEPR進行基因多態(tài)性分型，分型檢測均在上海交通大學Bio-X研究院的實驗平臺完成。基因多態(tài)性分型質(zhì)量控制采用隨機抽取10%的DNA質(zhì)量較高的樣本進行了重復分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 25.0、SHEsis軟件和R語言進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示；計數(shù)資料采用頻數(shù)(百分比)表示。計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。采用SHEsis軟件進行等位基因、基因型以及哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗。采用 logistic 回歸模型，多因素時校正年齡、性別、肝酶(谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶)以及血脂(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯)。分類變量具體賦值如下。因變量∶痰濕質(zhì)=1，非痰濕質(zhì)=0。自變量：LEPR rs11208659：CC=1，TC=2，TT=3；ADIPOQ rs182052: AA=1, AG=2, GG=3; 性別：男性=1，女性=2。連續(xù)性變量(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及年齡)直接放入模型進行分析。按檢驗水準α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 痰濕質(zhì)組患者與非痰濕質(zhì)組患者人口學特征和實驗室指標信息 見表1。性別和年齡在痰濕質(zhì)患者和非痰濕質(zhì)患者中具有顯著性差異，痰濕質(zhì)患者年齡比非痰濕質(zhì)患者平均高1歲；男性患者中痰濕質(zhì)人數(shù)較非痰濕質(zhì)人數(shù)多，而在女性患者中非痰濕質(zhì)人數(shù)遠遠高于痰濕質(zhì)人數(shù)。與非痰濕質(zhì)患者相比，痰濕質(zhì)患者BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓均高于非痰濕質(zhì)患者，高密度脂蛋白低于非痰濕質(zhì)患者(P<0.05)。谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、低密度脂蛋白、總膽固醇和甘油三酯在兩組中均未見統(tǒng)計學差異。

表1 人口學特征和實驗室指標在兩組患者中的比較

2.2 ADIPOQ、LEPR等位基因和基因型頻率與痰濕質(zhì)患者的相關(guān)性 見表2。LEPR rs1805094、rs11208659、rs4655537、rs12409877 和 ADIPOQ rs182052、rs3774261、rs6773957、rs17366568這8個位點在兩組患者中經(jīng)吻合度檢驗，均符合哈迪-溫伯格法則，表明數(shù)據(jù)來自同一遺傳群體。經(jīng)統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)只有ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659 這兩個位點在兩組患者中存在顯著性差異。ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點等位基因頻率在兩組中均有差異，ADIPOQ rs182052 G等位基因在痰濕質(zhì)患者中頻率高于非痰濕質(zhì)患者，痰濕質(zhì)患者LEPR rs11208659 T等位基因頻率顯著高于非痰濕質(zhì)組。在基因型分析中，ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點在兩組患者中均有差異。ADIPOQ rs182052 位點GG基因型在痰濕質(zhì)患者中的頻率分布高于非痰濕質(zhì)患者，痰濕質(zhì)患者的LEPR rs11208659位點TT基因型遠遠高于TC 基因型和CC基因型。

表2 ADIPOQ、LEPR等位基因和基因型頻率分析

2.3 NAFLD痰濕質(zhì)患者Logistics回歸模型分析 見表3。單因素邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)ADIPOQ rs182052基因為痰濕質(zhì)患者的危險因素。ADIPOQ rs182052 突變型GG基因攜帶者痰濕質(zhì)發(fā)生的風險是非痰濕質(zhì)發(fā)生風險的2倍[OR=2.104(1.24～3.578)]。進一步校正性別、年齡、肝酶以及血脂后，ADIPOQ rs182052 突變型GG基因攜帶者痰濕質(zhì)發(fā)生的風險仍是非痰濕質(zhì)發(fā)生風險的2倍[OR=2.274(1.303～3.967)]。表明ADIPOQ rs182052 野生型AA基因型是NAFLD痰濕質(zhì)患者的保護基因。

表3 NAFLD痰濕質(zhì)患者logistics回歸模型分析

2.4 痰濕質(zhì)患者ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659的遺傳模型分析 見表4。

表4 ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659遺傳模型在兩組患者中的比較 [n(%)]

在5種遺傳模型中，ADIPOQ rs182052和LEPR rs11208659位點在共顯性模型、顯性模型以及加性模型中均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。ADIPOQ rs182052在共顯性模型和顯性模型中，當以突變型GG基因型為參照時，AG和AA基因型為痰濕質(zhì)患者的保護因素；LEPR rs11208659在顯性模型中，當以突變型TT基因型為參照時，發(fā)現(xiàn)TC和CC基因型為痰濕質(zhì)患者的危險因素。NAFLD患者中C等位基因攜帶者痰濕質(zhì)發(fā)生的風險是非痰濕質(zhì)發(fā)生的2倍[OR=2.05(1.07～3.96)]。

3 討論

瘦素位于7號染色體q31.3位點，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，由146個氨基酸組成，是分子量為16 kD的脂肪組織源性多肽激素[14]。LEPR屬于1類細胞因子受體家族，可在人體多種組織器官中表達。Wellhoener等[15]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝是機體瘦素表達和分泌的主要決定因素。而肝臟又是脂肪代謝和葡萄糖調(diào)節(jié)的重要臟器，瘦素參與肝內(nèi)脂肪和葡萄糖代謝，通過增強葡萄糖-6磷酸激酶的活性，使得磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性增強，糖異生的效率增高，刺激肝糖原產(chǎn)生，而當LEPR位點發(fā)生突變時，瘦素在肝臟內(nèi)的生物學效應(yīng)不能正常發(fā)揮，致使葡萄糖-6磷酸激酶和PEPCK的活性降低，糖酵解活動增強，肝糖原減少，從而產(chǎn)生脂肪肝[16]。

ADIPOQ位于3號染色體q27.3，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，由244個氨基酸組成，是分子量為30 kD的分泌蛋白。主要是由脂肪細胞產(chǎn)生的一種保護肝臟的細胞因子，與脂肪水平成負相關(guān)。NAFLD的“一次打擊學說”認為其產(chǎn)生的原因是胰島素抵抗(IR)，IR主要通過兩種機制增加肝細胞中脂肪的沉積-脂解作用和高胰島素血癥[17]。當機體出現(xiàn)IR時，胰島素作用減弱，脂肪迅速分解以及葡萄糖利用能力下降，致使機體產(chǎn)生脂肪代謝紊亂，血糖濃度代償性升高。而ADIPOQ可以增加胰島素敏感性，通過降低葡萄糖-6磷酸激酶和PEPCK的生物學活性，從而刺激糖異生過程，維持細胞內(nèi)糖脂代謝的穩(wěn)態(tài)。而當ADIPOQ位點突變時，其不能增加胰島素敏感性以及糾正機體的脂肪代謝紊亂，從而引發(fā)脂肪肝[18]。

NAFLD屬中醫(yī)“痞滿”、“濕阻”、“肝癖”等范疇。國醫(yī)大師李振華教授認為NAFLD病位在肝，病機關(guān)鍵在脾，屬痰飲為患[19]?！督饏T要略》有云：“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。脾升胃降，為人體氣機之樞紐?！端貑枴れ`蘭秘典論》曰：“脾胃者, 倉廩之官, 五味出焉。”本研究人群均為老年人，具有虛、痰、瘀、郁等生理特點，其中以虛為主。飲食不節(jié)、勞逸失調(diào)等導致脾失健運，水谷精微失于運化，化為痰飲，阻滯于肝及情志失調(diào)，肝氣郁結(jié)，肝失疏泄，氣滯血瘀，使得痰瘀互結(jié)，本病而生[20]。

本研究結(jié)果提示：①LEPRrs11208659位點為NAFLD痰濕質(zhì)患者的危險因素，而ADIPOQrs182052位點為其保護基因；②ADIPOQ rs182052 野生型AA基因型為參照時，突變型GG基因型攜帶者痰濕質(zhì)的發(fā)病風險為野生型AA基因型攜帶者的2倍。

本研究從分子生物學角度分析了LEPR(rs1805094、rs11208659、rs4655537、rs12409877)和ADIPOQ(rs182052、rs3774261、rs6773957、rs17366568)基因多態(tài)性與NAFLD痰濕質(zhì)的相關(guān)性，初步揭示了ADIPOQ為NAFLD痰濕質(zhì)患者的保護基因，ADIPOQ rs182052位點突變可能是NAFLD痰濕質(zhì)患者的分子遺傳學基礎(chǔ)之一。本研究為NAFLD痰濕質(zhì)患者的早期預(yù)防提供一定的數(shù)據(jù)支持。痰濕質(zhì)是由于先天遺傳和后天嗜食肥甘厚膩，脾失健運，痰濕凝聚，以黏滯重濁為核心特征的體質(zhì)[21]。體質(zhì)具有后天可調(diào)性，因此中醫(yī)通過干預(yù)體質(zhì)來早期預(yù)防疾病有著獨特的優(yōu)勢，通過糾正或改善偏頗體質(zhì)，降低疾病的易感性，可預(yù)防或延緩疾病的發(fā)生發(fā)展，降低社會醫(yī)療負擔。本研究尚存諸多不足，如患者為65歲以上老年人，且樣本量相對偏少，仍需后期擴大樣本量展開進一步研究。