鄧加雄，王香，李桂成，李云峰

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，郴州 423000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上常見(jiàn)的危重癥，由于其治療藥物相對(duì)缺乏，具有極高的死亡率[1-3]，因此研究緩解ALI的有效藥物具有重要的臨床意義?；⒄溶帐菑闹兴幓⒄鹊母o中提取的單體，在抗休克、炎癥及治療燒傷方面有顯著作用[1,2,4]。我們的前期研究表明[5]，虎杖苷可以減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介導(dǎo)的ALI中細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，但機(jī)制并不明確。另有研究表明，線粒體損傷是ALI發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，抑制線粒體損傷可以減輕ALI發(fā)病[6,7]。而虎杖苷可以通過(guò)激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3(silent information regulator 2 related enzyme 3,SIRT3)保護(hù)線粒體，從而減輕失血性休克導(dǎo)致的腸損傷[4]。我們假設(shè)虎杖苷可通過(guò)SIRT3抑制線粒體損傷改善ALI，并通過(guò)LPS刺激A549細(xì)胞模擬ALI的體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，探討虎杖苷對(duì)LPS介導(dǎo)的線粒體損傷的影響，并進(jìn)一步分析SIRT3在其中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熒光素-熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；線粒體膜電位JC-1探針及鈣黃綠素-氯化鈷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針購(gòu)自上海碧云天公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (cell count kit-8,CCK-8)購(gòu)自上海Dojindo公司；SIRT3單克隆抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司；A549細(xì)胞購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物公司。

1.2 分組及處理

將A549細(xì)胞分為4組(n=6)：對(duì)照組為細(xì)胞僅接受0.1% DMSO處理7 h；模型組為細(xì)胞給予DMSO預(yù)處理，1 h后與LPS(5 mg/L)[3]共孵育6 h；治療組為細(xì)胞接受虎杖苷(50 μmol/L)[8]預(yù)處理，1 h后與LPS(5 mg/L)共孵育6 h；抑制劑組為細(xì)胞接受SIRT3抑制劑(50 μmol/L 3-TYP)[9]及虎杖苷50 μmol/L預(yù)處理，1 h后與LPS(5 mg/L)共孵育6 h。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

在96孔板中接種200 μl的細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同條件處理后棄上清，加入10 μl的CCK-8溶液及培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)A450 nm值，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 細(xì)胞ATP含量測(cè)定

采用熒光素-熒光素酶法檢測(cè)線粒體腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)水平。將細(xì)胞懸液加入96 孔白板，每孔100 μl(約2×104個(gè)細(xì)胞)。于室溫下加入等體積的CellTiter-Glo 檢測(cè)試劑，混勻細(xì)胞，并孵育10 min，用Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并以對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔狀態(tài)檢測(cè)

通過(guò)鈣黃綠素-氯化鈷檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondria permeability transition pore,mPTP)狀態(tài)。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，加入1 ml(濃度為1 μmol/L)染色工作液，并混合均勻，在37℃振蕩器中孵育10 min后，用Spectra Max M5酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。熒光強(qiáng)度下降表明mPTP開(kāi)放，熒光強(qiáng)度增加表明mPTP開(kāi)放被抑制。

1.6 細(xì)胞ROS檢測(cè)

采用DCFH-DA ROS熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后與5 μmol/L濃度的DCFH-DA工作液在37℃下共孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并且在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，并以對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 細(xì)胞線粒體膜電位測(cè)定

各組細(xì)胞處理后經(jīng)PBS緩沖液洗滌，重懸，與熒光探針JC-1(工作濃度5 μmol/L)在37℃孵育15 min后共聚焦顯微鏡下觀察。以紅色與綠色熒光的比值來(lái)衡量線粒體去極化的程度，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。比值越高表明線粒體去極化降低，線粒體膜電位(mitochondria membrance potential,MMP)增加，反之則去極化增加，膜電位下降。

1.8 SIRT3含量測(cè)定

Western blotting檢測(cè)SIRT3表達(dá)水平。各組細(xì)胞充分裂解，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，并以對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組細(xì)胞ATP水平、細(xì)胞活性及鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度比較

與對(duì)照組比較，模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞中ATP、細(xì)胞活性及鈣黃綠素?zé)晒饩@著下降 (P<0.05)；與模型組比較，治療組細(xì)胞上述指標(biāo)均顯著增加(P<0.05)；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞上述指標(biāo)又顯著下降(P<0.05；表1)。

表1 4組細(xì)胞ATP水平、細(xì)胞活性及鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度比較

Table 1 Comparison of ATP level, cell activity and calcein fluorescence intensity among four groups (n=6,

ATP: adenosine triphosphate; mPTP: mitochondria permeability transition pore. Compared with control group,*P<0.05; compared with modol group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.2 4組細(xì)胞ROS水平比較

與對(duì)照組(100.0±6.3)%比較，模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞ROS水平均顯著增加(P<0.05)，依次為(218.0±21.7)%、(180.0±18.1)%和(212.2±18.2)%。與模型組比較，治療組ROS水平顯著下降(P=0.001)；與治療組比較，抑制劑組ROS水平又顯著增加(P=0.003；圖1)。

2.3 4組細(xì)胞MMP比較

與對(duì)照組[(100.0±7.2)%]比較，模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞MMP均顯著下降(P<0.001)，依次為(54.0±6.5)%、(75.8±7.6)%和(62.8±6.2)%；與模型組比較，治療組細(xì)胞MMP顯著增加；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞MMP又顯著下降 (P=0.004；圖2)。

圖1 DCHF-DA法檢測(cè)4組細(xì)胞ROS水平

圖2 JC-1法檢測(cè)4組細(xì)胞MMP變化

2.4 4組細(xì)胞SIRT3表達(dá)比較

與對(duì)照組(100.0±11.8)%比較，模型組、治療組及抑制劑組細(xì)胞SIRT3表達(dá)顯著下降(P<0.05)，依次為(73.3±4.5)%、(86.7±7.6)%和(69.0±7.8)%；與模型組比較，治療組SIRT3表達(dá)顯著增加；與治療組比較，抑制劑組SIRT3表達(dá)又顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3)。

圖3 Western blotting檢測(cè)4組細(xì)胞SIRT3表達(dá)

3 討 論

ALI是創(chuàng)傷、感染等臨床危重癥的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，具有非常高的死亡率，因此一直是臨床工作中的棘手問(wèn)題[3]。我們前期研究證實(shí)，虎杖苷可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)減輕LPS介導(dǎo)的ALI，但機(jī)制尚未明確[5]。線粒體是普遍存在于真核生物的細(xì)胞器，因生命活動(dòng)所需的絕大多數(shù)能量都依賴(lài)于線粒體的合成，因此有細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”之稱(chēng)。不僅如此，線粒體還在自由基形成、細(xì)胞信息傳遞、中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10,11]。研究證實(shí)，肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制，線粒體可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)參與ALI[6,12]。而大量研究證實(shí)，虎杖苷可以通過(guò)抑制線粒體損傷，在抗休克及抗炎癥中發(fā)揮作用[1,13]。因此，本研究中探討了虎杖苷對(duì)肺泡上皮細(xì)胞線粒體的影響。

線粒體功能不全通常是由mPTP開(kāi)放引起[14]。在病理情況下，mPTP激活開(kāi)放，允許<1.5 ku的小分子物質(zhì)自由出入，此時(shí)線粒體內(nèi)外的電荷梯度減小，線粒體跨膜電位降低;另外電子傳遞鏈復(fù)合酶質(zhì)子泵功能發(fā)生障礙時(shí)，H+泵入線粒體膜間隙不足同樣也會(huì)引起線粒體跨膜電位降低[13,15]。在本研究中，我們通過(guò)鈣黃綠素-氯化鈷檢測(cè)mPTP開(kāi)放情況及膜電位去極化現(xiàn)象。正常情況下，鈷離子不能穿透線粒體膜，但在mPTP開(kāi)放時(shí)，鈷離子可以自由進(jìn)入線粒體，淬滅線粒體內(nèi)的鈣黃綠素?zé)晒?。我們的結(jié)果顯示，LPS刺激導(dǎo)致細(xì)胞鈣黃綠素?zé)晒鉁p弱，提示mPTP開(kāi)放，而虎杖苷可以抑制LPS介導(dǎo)的mPTP開(kāi)放。膜電位是維持線粒體正常功能的電位，正常線粒體是處于電壓內(nèi)負(fù)外正的極化狀態(tài)，是由質(zhì)子泵將H+由內(nèi)膜泵出到膜間隙所致，但在mPTP開(kāi)放時(shí)，因?yàn)樾》肿游镔|(zhì)(如H+)可以自由出入線粒體，使線粒體內(nèi)外的電荷梯度減小，跨膜電位降低[16]。我們的研究結(jié)果顯示，虎杖苷可以顯著抑制LPS介導(dǎo)的線粒體膜電位下降，這也與我們起初的假設(shè)是一致的。其次，線粒體是ATP生成的主要細(xì)胞器，本研究檢測(cè)了細(xì)胞的ATP水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激后的細(xì)胞ATP水平顯著下降，而虎杖苷可以使細(xì)胞內(nèi)ATP水平得到顯著恢復(fù)，提示虎杖苷可以緩解線粒體損傷。再者，當(dāng)線粒體損傷，電子傳遞鏈發(fā)生障礙后，線粒體生成ROS增多，此時(shí)堆積的ROS將線粒體DNA及mPTP作為靶點(diǎn)，反過(guò)來(lái)加重線粒體損傷。由此我們又檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎杖苷同樣可以抑制LPS介導(dǎo)的ROS生成增加?；谝陨辖Y(jié)果，本研究認(rèn)為虎杖苷可以顯著改善LPS介導(dǎo)的線粒體功能障礙。進(jìn)一步地，我們探討了虎杖苷減輕線粒體損傷的可能機(jī)制。

SIRT3是線粒體主要的去乙?；?，可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝關(guān)鍵酶的乙酰化水平，參與線粒體代謝及生成等，因此調(diào)控SIRT3可能作為治療線粒體損傷的作用靶點(diǎn)[17,18]。本課題組既往研究證實(shí)，大鼠休克后，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)下調(diào)，但上調(diào)SIRT3可以促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)的激活[9]。同時(shí)SIRT3也可以通過(guò)修飾呼吸鏈復(fù)合體減輕線粒體損傷[19]。本次研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞SIRT3表達(dá)顯著下降，而虎杖苷可以顯著提高SIRT3水平表達(dá)。研究證實(shí)，休克后線粒體錳超氧化物歧化酶(SOD2)乙?；皆黾?，導(dǎo)致線粒體ROS清除能力下降，而虎杖苷可以通過(guò)激活SIRT3，提高SOD2去乙?；宄齊OS，發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，從而改善失血性休克中的小腸損傷[4]。也有研究表明，虎杖苷可以通過(guò)SIRT1調(diào)節(jié)SOD2乙?；揎棧种凭€粒體損傷，減輕失血性休克中肝細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT3抑制劑3-YTP可以逆轉(zhuǎn)虎杖苷對(duì)線粒體的保護(hù)作用，提示虎杖苷可能通過(guò)激活SIRT3改善了LPS介導(dǎo)的線粒體功能障礙，但關(guān)于虎杖苷上調(diào)SIRT3的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，虎杖苷可以顯著改善LPS介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能障礙，而這有可能與虎杖苷激活SIRT3有關(guān)。