崔小麗,蔣 鋒,山 媛,趙 瑞,王 樂,袁 婕,張 強(qiáng),胡 軍*

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:monkey8031@163.com)

線粒體在人體細(xì)胞中功能重大,為人體重要的能量提供器官,它將外界攝取來的氨基酸、葡萄糖等小分子物質(zhì),通過位于其內(nèi)膜上呼吸鏈的氧化磷酸化作用來產(chǎn)生能量供應(yīng)機(jī)體需求。癲癇為神經(jīng)系統(tǒng)病變中的常見病,其一重要特征為發(fā)作的不可預(yù)知性[1,2],癲癇發(fā)作為腦神經(jīng)元的異常同步激活及異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成。目前有30%的癲癇患者為藥物難治性,這需要從其他機(jī)制入手,尋找新的抗癲癇藥物。癲癇持續(xù)狀態(tài)后能量代謝出現(xiàn)異常改變,線粒體的作用受到破壞。艾地苯醌與經(jīng)典藥物輔酶Q10相似,它的親脂電子載體和內(nèi)源性抗氧化功能在所有細(xì)胞線粒體膜中均具有[3],作用于線粒體的治療越來越受到人們重視,艾地苯醌獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)—穿越血腦屏障,使其受到研究者的關(guān)注,有研究表明,艾地苯醌通過調(diào)節(jié)大鼠海馬的抗氧化狀態(tài)、DNA損傷、鈉-鉀ATP的激活對(duì)匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[4],本研究觀察艾地苯醌能否減少癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠靜默期后的反復(fù)自發(fā)發(fā)作及可能機(jī)制探討。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清潔級(jí)別的SD(Spraque-Dawley)雄性實(shí)驗(yàn)大鼠,共42只,購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(陜)2007-001,動(dòng)物體質(zhì)量200-250 g,給予飲水自由、標(biāo)準(zhǔn)飲食,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(25±1)℃、濕度60±2%、照明12 h(早8:00-晚8:00)的光暗環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 建模時(shí)死亡6只,將36只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表等分為正常對(duì)照組,模型組及艾地苯醌干預(yù)組(每組12只)。

1.2.2 模型建立 首先將氯化鋰(3 meq/kg,美國Sigma公司)注射于實(shí)驗(yàn)大鼠的腹腔,17-20 h后將匹羅卡品(30 mg/kg,美國Sigma公司)注射于大鼠腹腔。為減輕建模時(shí)膽堿能作用,溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg,美國Sigma公司)注射于大鼠皮下,時(shí)間點(diǎn)為使用匹羅卡品前15-20 min,建模后約10 min觀察大鼠癲癇發(fā)作,發(fā)作等級(jí)按Racine法[5]評(píng)定(0級(jí):無任何行為變化;Ⅰ級(jí):面肌抽動(dòng),包含眨眼、節(jié)律性咀嚼、胡須抖動(dòng)等;Ⅱ級(jí):Ⅰ級(jí)+濕狗樣動(dòng)作及節(jié)奏性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):Ⅱ級(jí)+前肢陣攣;Ⅳ級(jí):Ⅲ級(jí)+后肢站立;Ⅴ級(jí):Ⅳ級(jí)+摔倒)。當(dāng)癲癇大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上SE表現(xiàn)并延續(xù)70 min,將地西泮注射液(10 mg/kg,西安利君精華藥業(yè)有限公司)注射于大鼠腹腔使發(fā)作停止,將等量生理鹽水注射于對(duì)照組大鼠腹腔。建模終止30 min后,在每只實(shí)驗(yàn)大鼠的皮下給予10 ml生理鹽水注射,用于補(bǔ)給建模時(shí)的耗損,死亡率明顯降低。造模后2 d,給予大鼠常規(guī)糊狀鼠糧,造模成功率約為80%。

1.2.3 艾地苯醌干預(yù) 艾地苯醌(60 mg/kg,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)溶于含5%羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)的生理鹽水中,建模終止后24 h,艾地苯醌干預(yù)組開始給予灌胃,每天1次,共28 d,其余兩組實(shí)驗(yàn)大鼠均給予等量含5%CMC的生理鹽水進(jìn)行灌胃。

1.2.4 錄像觀察大鼠行為學(xué)變化 由于匹羅卡品致癇大鼠模型,癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)后的反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作(spontaneous recurrent seizures,SRS)發(fā)生在白天的次數(shù)和單次持續(xù)時(shí)間較晚上明顯增多。所以錄像均選在白天(早8:00-晚8:00)。自癲癇持續(xù)狀態(tài)后第15天開始錄像,連續(xù)錄像觀察分析2周。觀察視頻由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)者分析,分析統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組達(dá)到發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)的持續(xù)時(shí)間和發(fā)作次數(shù)。

1.2.5 組織制備 連續(xù)給藥28 d后,以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)將各實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行麻醉,將胸腔打開后迅速暴露膈肌,將心包膜剝離,通過左心室直接到達(dá)主動(dòng)脈,將針頭牢固,瞬時(shí)將右心耳剪破,迅速灌注含0.37%的硫化鈉(Na2S)的生理鹽水,首先灌洗150 ml沖干凈血液,后使用固定液4%多聚甲醛(4 ℃,pH=7.4)灌洗固定,先較快速度灌注200 ml,再緩慢灌注200 ml。揭開顱骨,取出腦組織,入4%多聚甲醛進(jìn)行固定4-6 h,后入30%蔗糖溶液,4 ℃放置,持續(xù)到組織沉淀,冰凍切片機(jī)恒溫切取腦片,將海馬部分以冠狀位連續(xù)切片,設(shè)置厚度30 μm。

1.2.6 Timm染色及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 配制Timm染色液:50%阿拉伯膠60 ml(阿拉伯膠30 g+去離子水60 ml,攪拌混勻,放置24 h后用雙層紗布濾過),10 ml檸檬酸緩沖液(一水檸檬酸25.5 g+二水檸檬酸鈉23.5 g+去離子水100 ml),5.6%的對(duì)苯二酚30 ml,17%硝酸銀0.5 ml,將以上試劑于染色前在黑暗的實(shí)驗(yàn)室攪拌均勻。

Timm染色步驟:在暗室將海馬切片入Timm染色液里孵育1.5 h;在暗室用自來水沖刷海馬切片15 min;將海馬切片自暗室移出,再次用自來水沖刷15 min;常規(guī)脫水、透明、封片:依次入70%，80%，90%，100%乙醇各5 min,再入二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15 min,最后用中性樹膠封固。

海馬齒狀回內(nèi)分子層的Timm顆粒染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]:0分,無Timm顆粒;1分,Timm顆粒偶見,呈散在的點(diǎn)片狀分布;2分,Timm顆粒較多,呈片狀分布;3分,Timm顆粒分布接近連續(xù);4分,Timm顆粒呈接近連續(xù)或連續(xù)分布的濃密狀;5分,Timm顆粒呈連續(xù)分布層狀帶。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠行為學(xué)錄像分析

癲癇大鼠給予匹羅卡品腹腔注射后約15 min,出現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ級(jí)發(fā)作,繼而出現(xiàn)后肢站立等Ⅳ級(jí)及以上的發(fā)作。

2.2 艾地苯醌干預(yù)后減少了大鼠SRS的次數(shù)及持續(xù)時(shí)間

模型組和艾地苯醌干預(yù)組發(fā)作持續(xù)時(shí)間分別為(1 143.20±117.61)s和(148.27±35.32)s。模型組和艾地苯醌干預(yù)組發(fā)作次數(shù)分別為71±11.63和11.29±3.41。艾地苯醌干預(yù)組發(fā)作的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間較模型組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 艾地苯醌干預(yù)對(duì)海馬齒狀回異常的苔蘚纖維芽生(mossy fiber sprouting,MFS)的影響

各實(shí)驗(yàn)組Timm染色結(jié)果見圖1,各實(shí)驗(yàn)組海馬齒狀回Timm染色評(píng)分結(jié)果見圖2。正常對(duì)照組Timm染色評(píng)分為0.48±0.16,模型組為4.68±0.21,艾地苯醌干預(yù)組為1.61±0.31。與正常對(duì)照組相比,模型組的MFS明顯增加(P<0.05);與模型組相比,艾地苯醌干預(yù)組MFS減少明顯(P<0.05)。

A.模型組 B.正常對(duì)照組 C.艾地苯醌干預(yù)組圖1 艾地苯醌對(duì)各組癲癇大鼠海馬苔蘚纖維芽生的影響Figure1 Effect of idebenone on hippocampal mossy fiber sprouting in epileptic rats

與正常對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05圖2 各組MFS半定量評(píng)分比較Figure 2 Semi-quantitative analysis for MFS in each group

3 討論

癲癇是神經(jīng)科最為常見的疾病之一[1],全球大概有6千萬病患受該病困擾,有部分患者治療效果欠佳,目前藥物不能阻止該疾病或阻斷其發(fā)展,僅僅是控制發(fā)作癥狀。長(zhǎng)時(shí)間的癲癇發(fā)作和不能較快完全控制發(fā)作,對(duì)社會(huì)及患者身體和心理均影響極大,這將導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降,經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重。癲癇的一個(gè)臨床特征是反復(fù)自發(fā)發(fā)作,據(jù)估計(jì)高達(dá)50%的患者發(fā)病源于一開始的創(chuàng)傷,如癲癇持續(xù)狀態(tài)、中風(fēng)、腦外傷等,高達(dá)30%的癲癇患者對(duì)目前抗癲癇藥物反應(yīng)欠佳,有實(shí)驗(yàn)表明[7],生物要素和環(huán)境要素均促成了藥物難治性癲癇的產(chǎn)生。盡管有大量的臨床前及臨床研究,但對(duì)癲癇發(fā)生的機(jī)制仍了解有限。在癲癇發(fā)作期神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)激活,能量需求增加,腦代謝和腦血流量增加[6,8],這和氧化應(yīng)激有關(guān)[9,10]。有研究表明,在健康大鼠腦室內(nèi)注射葡萄糖的類似物D-2-脫氧葡萄糖,以達(dá)到緩慢部分阻斷腦內(nèi)糖酵解,可以誘發(fā)癲癇發(fā)生[9,11]?，F(xiàn)有研究表明,迅速并持續(xù)阻斷腦內(nèi)葡萄糖消耗,可導(dǎo)致氧化應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致癲癇發(fā)生[12]。有研究表明[13],三種不同的癲癇模型中,給予丙酮酸可以抗驚厥發(fā)作。這表明能量代謝在癲癇發(fā)生中意義重大。除了增強(qiáng)有氧代謝外,多余的葡萄糖通過無氧代謝轉(zhuǎn)化為乳酸,在癲癇患者、癲癇動(dòng)物及體外癲癇模型均可見癲癇發(fā)作時(shí)有乳酸堆積[14]。單羧酸轉(zhuǎn)用蛋白介導(dǎo)乳酸的攝取和釋放,這依賴于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力和濃度梯度[15]。由于跨膜離子梯度的恢復(fù)是由能量消耗泵機(jī)制介導(dǎo)的,因此癲癇發(fā)作對(duì)大腦的能量代謝造成了巨大的負(fù)擔(dān)。破壞了能量代謝,改變了神經(jīng)活動(dòng)后組織跨膜離子濃度梯度的改變,進(jìn)而導(dǎo)致了癲癇發(fā)作,這在線粒體腦病[16]和顳葉癲癇[17]中均可見。

艾地苯醌為一可溶性的輔酶Q10類似物,較輔酶Q10更易于穿過血腦屏障[18],可以激活線粒體功能、促進(jìn)ATP的生成、抗氧化及去除自由基。艾地苯醌已被用來治療神經(jīng)退行性疾病和病因?yàn)榫€粒體功能障礙的患者[19]。臨床前實(shí)驗(yàn)報(bào)道艾地苯醌有神經(jīng)保護(hù)作用,可對(duì)抗β淀粉樣蛋白產(chǎn)生的神經(jīng)毒性,既往研究表明艾地苯醌對(duì)癲癇大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn),艾地苯醌可以減少癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠后期的反復(fù)自發(fā)發(fā)作。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞軸突的異常抽芽,即苔蘚纖維芽生(mossy fiber sprouting,MFS),為癲癇中一個(gè)重要的病理變化[20],MFS的形成發(fā)生在兩個(gè)階段:①損傷本身導(dǎo)致了神經(jīng)元的激活和釋放生長(zhǎng)因子;②顆粒細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)和延伸[21]。在形態(tài)學(xué)上,海馬齒狀回包含三層:自內(nèi)向外為多形細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、分子層,分子層為無細(xì)胞層,包含顆粒細(xì)胞的頂樹突和傳遞信息的興奮末梢,這些信息或來自于內(nèi)嗅皮層,或來自于聯(lián)合投射區(qū)。顆粒細(xì)胞層密集分布著小直徑的胞體(即顆粒細(xì)胞),顆粒細(xì)胞軸突延伸到門區(qū),首先投射到興奮性中間神經(jīng)元(苔蘚細(xì)胞)和抑制性中間神經(jīng)元,然后穿過透明層,到達(dá)突觸,連接CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元。在癲癇的海馬齒狀回組織,門區(qū)丟失了苔蘚纖維的投射靶點(diǎn),異常的苔蘚纖維,并延伸到內(nèi)分子層,與顆粒細(xì)胞樹突的近端部分形成興奮性突觸連接。

在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇動(dòng)物模型中,可見到苔蘚纖維軸突重組在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的標(biāo)本中,使用Timm染色,可以見到大量濃密的富含鋅顆粒的苔蘚纖維,在海仁酸誘導(dǎo)的癲癇模型及其他癲癇動(dòng)物模型中也有類似的發(fā)現(xiàn)[22,23]。在海仁酸誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)前給予哌立福辛預(yù)處理,可以抑制神經(jīng)元的死亡和MFS,減少反復(fù)自發(fā)發(fā)作[24]。在匹羅卡品誘導(dǎo)的SE大鼠模型中,給予靜脈輸注大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,有神經(jīng)保護(hù)作用,可以減少認(rèn)知損害、抑制MFS,其結(jié)論是,移植可能通過抑制異常MFS來減少癲癇的發(fā)生[25]。我們的研究表明艾地苯醌可以減少苔蘚纖維芽生,與上面這些研究一致。減少苔蘚纖維芽生可能是減少癲癇發(fā)生的機(jī)制之一

本研究表明,艾地苯醌可以減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后自發(fā)性癲癇發(fā)作,提示艾地苯醌成為臨床上治療癲癇的新方法。我們還需要進(jìn)一步探討其他給藥時(shí)間窗、給藥時(shí)間的長(zhǎng)短及其他可能的機(jī)制研究,以期臨床上能夠治療難治性癲癇。