郭一凡(綜述) 樊 冰(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200032)

血管新生是一個(gè)動(dòng)態(tài)、多階段的生理過(guò)程,需要多種協(xié)調(diào)活動(dòng),通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)的增殖、遷移和分化,最終在原有血管的部位以出芽的形式形成新的微血管[1]。在正常成年人體內(nèi),血管新生受到精確調(diào)控,僅發(fā)生在胎盤血液循環(huán)的建立、卵巢周期中或傷口愈合的止血步驟之后[2]。生理?xiàng)l件下,血管新生只會(huì)在一段特定的時(shí)間內(nèi)被激活(通常是幾天或幾周),隨后就會(huì)被抑制,而不適當(dāng)?shù)某掷m(xù)性血管新生往往與一系列疾病如腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變等有關(guān)[3]。血小板調(diào)節(jié)血管新生的機(jī)制包括:(1)釋放多種促/抑血管新生蛋白:血小板α-致密顆粒中儲(chǔ)存大量調(diào)控血管新生的生長(zhǎng)因子,血管新生激活蛋白包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor,SDF-1)等;血管新生抑制蛋白包括內(nèi)皮抑素(endostatin)、血小板因子4(platelet factor,PF4)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)、纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI)、血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)等;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor,TGF-β)具有促進(jìn)和抑制血管新生的雙重作用[3-4]。(2)釋放磷脂類信號(hào)分子:活化的血小板釋放出具有生物活性的磷脂分子,其中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)參與調(diào)節(jié)成血管反應(yīng)中最關(guān)鍵的第二信使[3,5];(3)血小板微泡(platelet microvesicles,PMVs):又稱為血小板微顆粒(platelet microparticles,PMPs),是從活化的血小板上脫落的脂膜,具有與血小板類似的重要生物功能[6],在血管新生中發(fā)揮重要作用[7];(4)對(duì)ECs的作用:ECs是血小板釋放的多種細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞,來(lái)自血小板的成血管信號(hào)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的表型改變,進(jìn)而發(fā)生增殖和遷移。此外,血小板釋放產(chǎn)物(platelet releasates,PRs)還能增強(qiáng)ECs集落形成細(xì)胞(endothelial colony forming cells,ECFCs)的成血管作用[8]。此外,血小板微顆粒還能通過(guò)與ECs相互作用促進(jìn)血管新生過(guò)程[9]。同時(shí),ECs也能釋放一系列血管生成因子,對(duì)穩(wěn)定血管壁有積極作用[10]。部分血小板釋放的促/抑血管新生分子見(jiàn)圖1。

HGF,TGF-β1 and S1P enhance both pro- and anti-angiogenic responses.D:Dense granule,L:Lysosome.

圖1 由α-顆粒釋放的促/抑血管新生分子
Fig 1 Pro- and anti-angiogenic factors released by α-granule

血小板顆粒血小板內(nèi)含有的顆粒主要有3類:α-顆粒、致密體和溶酶體,其中α-顆粒為血小板內(nèi)含量最多,內(nèi)容最豐富的顆粒[11]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明α-顆粒能釋放上百種可溶性分子,參與包括凝血、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化形成、傷口愈合和血管新生在內(nèi)的一系列生理及病理過(guò)程。在這些分子中,研究最多的是促進(jìn)血管新生的VEGF和抑制血管新生的內(nèi)皮抑素。這些不同的血管新生調(diào)節(jié)因子被包裝在形態(tài)不同的α-顆粒中,當(dāng)不同的蛋白酶激活受體(protease activated receptors,PARs)被激活時(shí),有選擇性地被釋放。PAR-1被激活時(shí)釋放VEGF,PAR-4被激活時(shí)釋放內(nèi)皮抑素[12-14]。與之相似的是,有研究報(bào)道堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和TSP-1同樣被分裝在不同的α-顆粒內(nèi)[12]。另一些研究提出了不同的結(jié)論。Kamysowski等[15]在高分辨率熒光顯微鏡下雖然未觀察到不同亞型的α-顆粒,但觀察到細(xì)胞因子在α-顆粒內(nèi)存在特定的空間分布,van Nispen等[16]也觀察到相似的結(jié)果。Etulain等[17]用不同的蛋白酶激活受體激動(dòng)蛋白(PAR-activator protein,PAR-AP)分別激活PAR-1和PAR-4,觀察人血小板產(chǎn)生VEGF和內(nèi)皮抑素的總體效應(yīng),發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的內(nèi)皮抑素維持抑制血管新生的穩(wěn)定狀態(tài),而在PAR-1與PAR-4激活后,α-顆粒通過(guò)分泌VEGF促進(jìn)血管新生。Jonnalagadda等[18]則發(fā)現(xiàn)血小板分泌細(xì)胞因子的總量和速率受激活劑強(qiáng)度的影響,但不會(huì)因激動(dòng)劑種類不同而對(duì)血管產(chǎn)生不同的效應(yīng),側(cè)面支持了Etulain等[17]的結(jié)論。這些矛盾的研究結(jié)果表明,雖然血小板對(duì)血管新生的總體效應(yīng)是促進(jìn)的,但現(xiàn)階段對(duì)α-顆粒釋放產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很有限,需要進(jìn)一步對(duì)控制α-顆粒分泌的生物化學(xué)過(guò)程及其產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。闡明α-顆粒分泌細(xì)胞因子的機(jī)制有助于理解血小板在多種生理和病理狀態(tài)下對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)作用,從而為調(diào)控該生物學(xué)過(guò)程的新藥研發(fā)提供設(shè)計(jì)思路。α-顆粒對(duì)血管新生的總體促進(jìn)效應(yīng)也提示,抗血小板治療可能在與血管新生異常有關(guān)的疾病中起保護(hù)作用。

除α-顆粒外,King等[19]通過(guò)對(duì)載脂蛋白E(ApoE)和HSP3基因缺陷小鼠的研究發(fā)現(xiàn),在HSP3基因缺陷導(dǎo)致致密顆粒分泌缺乏的小鼠模型中,動(dòng)脈血栓形成、炎癥反應(yīng)和內(nèi)膜增生程度均高于對(duì)照組小鼠。因此,血小板致密顆粒分泌缺乏對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生具有保護(hù)作用,提示致密顆粒中的分泌物對(duì)血管重建有調(diào)控作用,但其對(duì)血管重塑的影響是否獨(dú)立于促血栓和促炎作用還有待進(jìn)一步研究。

血小板磷脂血小板磷脂是由α-致密顆粒釋放的信號(hào)分子[20],也被稱為磷脂生長(zhǎng)因子(phospholipid growth factor,PGF),其化學(xué)本質(zhì)為磷脂而非蛋白。在活化的血小板所釋放多種生物活性磷脂分子中,LPA、PA和S1P與血管新生反應(yīng)關(guān)系最密切。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),磷脂類信號(hào)分子的受體主要是內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(endothelial cell differentiation gene,EDG)受體,該受體是一類G蛋白耦聯(lián)受體,在組織和細(xì)胞中廣泛分布,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、穩(wěn)定和細(xì)胞骨架構(gòu)建具有重要作用[21-22]。在所有磷酯類信號(hào)分子中,S1P的研究最為廣泛,它是由鞘氨醇經(jīng)過(guò)鞘氨醇激酶(SphK1和SphK2)磷酸化后形成的生物活性分子[23]。S1P對(duì)包括維持動(dòng)脈緊張度、血管新生、神經(jīng)發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞屏障穩(wěn)定在內(nèi)的多種血管生理過(guò)程具有調(diào)控作用[24-27],被認(rèn)為是一種具有促血管新生作用的信號(hào)分子。S1P受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族,已知有S1P1～S1P5 5種類型[28]。隨著對(duì)S1P受體和信號(hào)通路的逐步認(rèn)識(shí),發(fā)現(xiàn)S1P對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)具有雙重性,并非單一的促進(jìn)作用。Gaengel等[29]發(fā)現(xiàn),S1P與S1P1結(jié)合后,能夠抑制VEGFR2信號(hào)通路,提高VE-鈣黏素在內(nèi)皮細(xì)胞連接間的穩(wěn)定性,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Ben等[30]也證實(shí)在血管形成的過(guò)程中,S1P1具有維持新生血管正常形態(tài),并負(fù)性調(diào)節(jié)出芽式血管新生。Mascall等[31]通過(guò)對(duì)ECs、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)S1P還能通過(guò)S1P2受體激活ROCK通路,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞釋放TIMP2,發(fā)揮抑制血管新生的作用。Mousseau等[32]的研究也得出了相似結(jié)論,提示S1P對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)作用很可能與細(xì)胞表達(dá)的S1P受體類型和組織微環(huán)境有關(guān)。在心肌梗死后,血管新生對(duì)挽救心肌細(xì)胞、恢復(fù)心臟功能具有重大意義,目前以心功能重建為目的的心肌干細(xì)胞移植面臨著由于血管新生不良等因素導(dǎo)致的心肌干細(xì)胞成活與分化率低的嚴(yán)峻問(wèn)題[33]。S1P作為能同時(shí)與ECs和平滑肌細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系的信號(hào)分子,對(duì)其調(diào)節(jié)血管新生機(jī)制的深入研究,可能為心肌梗死后心臟功能重建提供新的作用靶點(diǎn)和治療思路。

PMPsPMPs是從活化的血小板上脫落的一小塊脂膜,直徑通常為0.1～1 μm。Kim等[7]在體外人臍靜脈ECs培養(yǎng)中首次發(fā)現(xiàn)PMPs能促進(jìn)ECs的增殖和存活,該研究還表明PMPs對(duì)血管發(fā)育的作用是通過(guò)VEGF、FGF-2以及磷脂成分(如S1P)共同完成的。PMPs對(duì)血管新生的調(diào)控作用正在逐漸被認(rèn)識(shí)。Brill等[34]對(duì)大鼠心肌缺血模型的研究也證實(shí)PMPs能通過(guò)釋放VEGF促進(jìn)血管新生。此外,Hayon等[35]在大鼠腦缺血模型中證實(shí)PMPs具有劑量依賴的促進(jìn)血管和神經(jīng)組織新生的作用,該結(jié)果同時(shí)被另一項(xiàng)由Shan等[36]完成的關(guān)于PMPs對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的研究所支持。Mause等[37]發(fā)現(xiàn),PMPs還可以與具有成血管作用的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞(early outgrowth cells,EOCs)發(fā)生生物膜的同化與合并,從而促進(jìn)EOCs的表面抗原向ECs轉(zhuǎn)換,并誘導(dǎo)EOCs的分泌蛋白質(zhì)組向促進(jìn)ECs增殖、遷移及成毛細(xì)血管的方向轉(zhuǎn)化。與該研究相符合的是,用動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中分離得到的PMPs預(yù)處理血液循環(huán)中的成血管細(xì)胞后,可以促進(jìn)下肢缺血大鼠體內(nèi)的血管新生,該促血管新生效應(yīng)依賴于PMPs釋放的正常T淋巴細(xì)胞表達(dá)和分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白[38]。一系列研究提示PMPs具有重要的臨床意義,在與異常血管新生相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用中或許可以作為預(yù)后因子或新的治療靶點(diǎn)。PMPs調(diào)節(jié)血管新生的主要機(jī)制如圖2所示。

PMPs release different pro-angiogenesis cytokines such as VEGF,PDGF,bFGF,S1P to induce EC proliferation,migration and differentiation.In addition,PMPs upregulate the expression of membrane receptors on EOC,which induces EOC differentiation to EC,and release pro-angiogenesis molecules including VEGF,EGF,HGF,GM-CSF,etc.

圖2 PMP作用于EOC及EC調(diào)節(jié)血管新生
Fig 2 PMP regulates angiogenesis by exerting influences on EOC and EC

血小板源產(chǎn)物的臨床應(yīng)用雖然血小板促進(jìn)血管新生的具體機(jī)制尚未完全闡明,但其臨床應(yīng)用前景已受到廣泛重視。已有研究嘗試?yán)醚“迥z、富血小板血漿、血小板裂解產(chǎn)物等血小板源產(chǎn)物促進(jìn)體表創(chuàng)傷的愈合[39]、修復(fù)心梗后的心肌組織[40-41]、保護(hù)缺血性心肌病中遭受缺血再灌注損傷的心肌[41-42]、減輕缺血性腦卒中對(duì)局部腦神經(jīng)組織的損傷[43]。Cheng等[40]利用免疫染色和微血管造影的方法在大鼠體內(nèi)證實(shí),血小板凝膠具有促進(jìn)毛細(xì)血管新生、保護(hù)心梗后損傷心肌的作用,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在此過(guò)程中一些具有促血管新生作用的基因(如HGF,bFGF)被上調(diào)了。該研究認(rèn)為血小板凝膠的促血管新生作用與其提供的物理支架環(huán)境與血小板分泌的各類可溶性成分有關(guān)。血小板促血管新生的作用在缺血導(dǎo)致的表皮損傷中也引起了重視,Anitua等[44]嘗試通過(guò)皮下注射富含生長(zhǎng)因子的血小板濃縮液,治療后肢缺血模型小鼠的表皮損傷,在注射后對(duì)小鼠后肢進(jìn)行正電子斷層掃描及免疫組化分析后發(fā)現(xiàn),血小板濃縮液可以顯著促進(jìn)血管新生,增加缺血部位的血流灌注,加速肌肉修復(fù),并促進(jìn)缺血部位傷口的愈合。

對(duì)血小板促血管新生作用的認(rèn)識(shí)拓寬了臨床中對(duì)下肢缺血損傷或糖尿病足部潰瘍的治療手段,也為心梗后心肌組織的修復(fù),心功能的重建帶來(lái)啟發(fā)。富血小板血漿制成的凝膠已經(jīng)在下肢缺血性病變和糖尿病足部潰瘍的患者中得到應(yīng)用并取得了良好效果,可以有效加速血管新生,促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,具有良好的生物相容性、無(wú)毒、治療花費(fèi)低廉等優(yōu)點(diǎn),具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[45-46]。

結(jié)語(yǔ)隨著越來(lái)越多的分子機(jī)制和信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn),提示血小板對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)處于精確而嚴(yán)密的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)之中,使機(jī)體在需要時(shí)促進(jìn)血管新生,并在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候抑制血管異常增殖,同時(shí)保證新生血管形態(tài)規(guī)則完整,維持功能穩(wěn)定。血管新生在多種生理或疾病中的關(guān)鍵地位決定了對(duì)血小板調(diào)節(jié)血管新生研究的重要臨床意義,不僅能為疾病的精準(zhǔn)治療提供可能靶點(diǎn),也可能作為某類疾病的預(yù)測(cè)、診斷、評(píng)價(jià)或預(yù)后因子,有助于正確認(rèn)識(shí)抗血小板治療以及血小板成分輸血治療在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。對(duì)血小板調(diào)控血管新生認(rèn)識(shí)的加深可為臨床中以缺血為主要病理基礎(chǔ)的疾病,如心肌梗死、缺血性腦卒中、下肢缺血性疾病、糖尿病足部潰瘍等提供了新的治療思路,從而優(yōu)化治療策略,解決相應(yīng)的臨床問(wèn)題。