侵襲性垂體泌乳素腺瘤中GPER1基因表達(dá)的變化

李 珺 張 義

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科 上海 200240)

泌乳素(prolactin,PRL)腺瘤是激素分泌性腺瘤中最常見的一種,約占垂體腺瘤的 30%,部分腫瘤雖為良性,但仍有侵襲性生長的惡性腫瘤表現(xiàn)。男性患者臨床表現(xiàn)與女性不同,女性的泌乳素腺瘤大多是微腺瘤,男性則有就診年齡大、腫瘤大、泌乳素水平高和腫瘤侵襲性生長等特點(diǎn)[1]。妊娠和雌激素替代療法也會(huì)導(dǎo)致泌乳素瘤增大[2-3]。泌乳素腺瘤全切率低,與其他類型的垂體腺瘤相比具有更快的侵襲速度[4],因此臨床預(yù)后差。尋找敏感的生物標(biāo)志物將有助于鑒定泌乳素瘤的侵襲性,協(xié)助臨床治療。

眾所周知,雌激素受體(estrogen receptor,ER)與垂體腫瘤侵襲作用密切相關(guān)[5-6]。但是很早就有學(xué)者提出傳統(tǒng)ER并不足以完成雌激素的全部作用[7-8]。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)是一種由GPER基因編碼的蛋白質(zhì),曾被稱作G蛋白偶聯(lián)受體30。GPER1與雌二醇結(jié)合并被其激活,發(fā)揮其獨(dú)立于傳統(tǒng)ER并且快速的受體作用,因此被視為具有獨(dú)立作用的新型ER[9-10]。研究表明,GPER1與GPER雌激素結(jié)合后,不依賴傳統(tǒng)途徑,可以快速活化細(xì)胞內(nèi)第二信使信號(hào),參與雌激素非核效應(yīng)調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。已知GPER1在乳腺癌細(xì)胞中具有抑制作用,其表達(dá)減少可造成乳腺癌進(jìn)展,但在其他雌激素相關(guān)腫瘤的作用尚不明確。本研究采用免疫組化和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法研究侵襲性泌乳素腺瘤中GPER1基因表達(dá)的變化,為泌乳素腺瘤侵襲機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ),可為未來的基因治療提供新的靶點(diǎn)[13],為尋找新的分子生物標(biāo)志物評(píng)價(jià)泌乳素瘤的侵襲性提供理論依據(jù)。

資 料 和 方 法

臨床病例資料選取2012—2017年復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的泌乳素腺瘤患者共102例,根據(jù)其頭顱MR表現(xiàn)參考Knosp[14]方法分為侵襲性泌乳素腺瘤組(侵襲組)和非侵襲性泌乳素腺瘤組(非侵襲組)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)接受2次手術(shù)治療;(2)使用溴隱亭治療。102例患者中,80例最終納入研究,其中侵襲組37例、非侵襲組43例。詳細(xì)記錄各例患者性別、年齡及術(shù)前泌乳素水平。

本研究獲復(fù)旦大學(xué)第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2012[021])。所有患者均簽署知情同意書。本研究按照《赫爾辛基宣言》原則進(jìn)行。

免疫組化手術(shù)切除垂體瘤標(biāo)本制成蠟塊,制作4.0 μm切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)采用LSAB法(labeled streptavidin-biotin,抗生物素蛋白鏈菌素-生物素標(biāo)記法)。GPER1一抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。通用型SP-Kit和DAB由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

組化實(shí)驗(yàn)由兩名病理實(shí)驗(yàn)員同時(shí)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)員對(duì)患者資料并不知情。染色結(jié)果進(jìn)行HPF半定量分析:以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計(jì)分。組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性細(xì)胞標(biāo)志。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1,標(biāo)準(zhǔn)組化示例見圖 1。

表1 GPER1 免疫組化染色 HPF 半定量分析評(píng)分法Tab 1 GPER1 immunohistochemical staining HPF semi-quantitative analysis scoring method

A:Weak positive;B:Mid positive;C:Strong positive.

圖 1 HPF 半定量分析標(biāo)準(zhǔn)組化示例(×400)
Fig 1 HPF semi-quantitative analysis standard sample (×400)

熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)將組織樣本在無RNA酶的研缽中液氮研磨,Trizol(lot A7205-1,大連TaKaRa生物有限公司)充分裂解細(xì)胞提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(lot EP0441,上海賽默飛世爾科技有限公司)和oligo dT (lot S1316S,上海NEB公司)根據(jù)操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物設(shè)計(jì)為GPER1(正向):5’-GCA GGT CCA GCA GAG GTA CA-3’,GPER1 (反向):5’-TGG TTT GGG TTG GGT TTG TTA-3’ (278bp);甘油醛 3- 磷酸脫氫酶(GAPDH) (正向):5’-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TG-3’,GAPDH (反向):5’-GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT-3’(145 bp)。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用目的基因特異性引物和內(nèi)參引物擴(kuò)增待檢測(cè)的目的基因片段和看家基因,摸索適合qPCR上機(jī)的最佳引物退火溫度和模板量,若有雜帶應(yīng)重新調(diào)整PCR過程中的退火溫度,直至雜帶消失。最后以GAPDH作為內(nèi)部控制,使用SYBR Green Mix(中國廣州東盛生物科技有限公司)在Eppendorf Mastercycler ep Realplex 熒光定量PCR系統(tǒng)中(德國漢堡 Eppendorf 生物技術(shù)公司)進(jìn)行特異性mRNA定量Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)包括在95 ℃初始變性2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,然后 72 ℃ 20 s循環(huán)40次。計(jì)算2-ΔΔCT代表相對(duì)目標(biāo)基因的mRNA水平。

結(jié) 果

臨床資料分析侵襲組病例37人,非侵襲組病例43人,患者的臨床特點(diǎn)及其術(shù)前泌乳素水平見表2。侵襲組平均年齡與非侵襲組平均年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.94)。侵襲組女性17人,男性20人;非侵襲組女性25人,男性18人。侵襲組術(shù)前泌乳素水平與非侵襲組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.869)。

表2 侵襲組與非侵襲組泌乳素腺瘤患者臨床數(shù)據(jù)分析Tab 2 Characteristics of prolactinomas patients with or without invasive tumor

免疫組化結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示瘤細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)的黃色顆粒為GPER1蛋白質(zhì)。放大400倍光鏡觀察侵襲性垂體瘤組織標(biāo)本中表達(dá)較少,顏色偏淡,多呈淡黃色;在非侵襲性垂體瘤組織標(biāo)本中顏色濃郁,多呈深褐色。通過計(jì)算,侵襲組蛋白質(zhì)陽性度平均值較非侵襲組低,侵襲組為3.8 (2.2～6.6),非侵襲組為11.2 (6.0～12.0)(P<0.001,圖2)。為了去除混雜因素影響,本研究還針對(duì)兩組不同的臨床特征可能對(duì)GPER1表達(dá)產(chǎn)生影響的因素進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)比較,結(jié)果顯示不同性別的泌乳素腺瘤患者GPER1蛋白質(zhì)水平未見明顯差異,表3顯示GPER1蛋白質(zhì)水平僅與垂體瘤侵襲行為有關(guān),與其他臨床特征無關(guān)。

A:GPER1 protein staining in invasive pituitary tumor showing weak staining (+) (×400).B:GPER1 protein staining in non-invasive pituitary tumor showing strong staining (+++) (×400).C:Box-plot of GPER1 protein expression in male and female prolactinomas patients (data reported as median and IQR);D:Box-plot of GPER1 protein expression in prolactinomas patients with invasive or not (data reported as median and IQR).

圖2 泌乳素腺瘤患者GPER1蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果
Fig 2 Immunohistochemical results of GPER1 protein in patients with prolactin adenoma

表3 兩組間不同臨床特征的 GPER1 蛋白質(zhì)水平的陽性度平均值比較Tab 3 Grade distribution of GPER1 protein level in prolactinomas patients with different characteristics [n (%)]

熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)非侵襲組GPER1 mRNA水平為1.93 (1.00～4.70),顯著高于侵襲組[0.47 (0.03～2.30)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021,圖 3)。此結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。

Data reported as median and IQR.

圖3 real-time RT-PCR分析兩組患者
相對(duì)GPER1 mRNA 水平
Fig 3 Relative GPER1 mRNA level in patients of twogroups by real-time RT-PCR

Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型將侵襲組與非侵襲組各患者的年齡、性別、瘤體大小、術(shù)前血清泌乳素水平及GPER1 mRNA基因水平與垂體瘤復(fù)發(fā)時(shí)間做相關(guān)性分析(表4、圖4)。按照 GPER1 mRNA水平分組,校正年齡和腫瘤大小之后發(fā)現(xiàn),不同表達(dá)水平的GPER1對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.48)。

表 4 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)GPER1 mRNA水平與患者預(yù)后的相關(guān)性分析結(jié)果Tab 4 The relationship of GPER1 mRNA level with the prognosis of patients by Cox proportional risk model analysis

討 論

泌乳素腺瘤是一種常見的垂體腫瘤,雌激素在其發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。GPER1屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs),其作用獨(dú)立于雌激素受體(ER)α 和(ER)β。GPER1刺激增加產(chǎn)生GPER1 Gαs。此外,GPER1的激活導(dǎo)致肝素結(jié)合生長因子(HB-EGF)的激活和釋放,進(jìn)而激活表皮生長因子受體,然后磷酸化MAPK[16]。

The effect of different levels of GPER1 mRNA on tumor recurrence was not statistically significant,P=0.48.

圖4 不同 GPER1mRNA 水平患者復(fù)發(fā)生存曲線(校正年齡和腫瘤)
Fig 4 Recurrence survival curve of patients with differentGPER1 mRNA levels (adjusted for age and tumor size)

2014年 Lappano等[17]研究了GPER1 (又稱GPR30)受體在不同的細(xì)胞類型中對(duì)雌激素信號(hào)的影響,發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體的激活是GPER1觸發(fā)的生物作用中的一個(gè)基本整合點(diǎn)。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn),天然和合成雌激素可激活GPER1,并在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中起作用。還有研究表明,雌激素與GPER1特異性配體G.1結(jié)合可調(diào)控ERKl、ERK2等信號(hào)通路,從而進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖[18-22]。有研究表明,GPER1表達(dá)的大鼠初級(jí)精子細(xì)胞與GPER1結(jié)合后,E2、G.1可激活EGFR/ERK/c-Jun通路,進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)[22]。其他學(xué)者[23-24]的實(shí)驗(yàn)研究再次強(qiáng)調(diào)了GPER1在癌細(xì)胞侵襲時(shí)的抑制作用。本研究與上述研究結(jié)論相符,GPER1 表達(dá)降低的腫瘤侵襲性增高。

然而,GPER1的具體作用通路尚不清楚,GPER1基因的低表達(dá)的機(jī)制是什么,仍是研究的熱點(diǎn)。Manjegowda等[25]的研究分析了不同乳腺癌細(xì)胞中GPER1 mRNA的水平,使用RT-PCR檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中GPER1基因座兩個(gè)CpG島的甲基化狀態(tài),通過改良COBRA法和亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)GPER1 mRNA。結(jié)果表明,MCF-7細(xì)胞GPER1 mRNA表達(dá)水平較高,與MDA-MB-231細(xì)胞相比,COBRA檢測(cè)顯示GPER1 mRNA表達(dá)水平存在差異甲基化。結(jié)果證明了DNA甲基化在 GPER1 抑制中的作用。

細(xì)胞研究證實(shí),GPER/ERK信號(hào)通路與細(xì)胞生長、存活和遷移有關(guān)[26]。Jiang等[27]的體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)雌激素信號(hào)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān),可能通過 GPER1/ERK&AKT/NFκ-B/引發(fā)CXCR1 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有關(guān)GPER在激素分泌性垂體腺瘤中的分子機(jī)制研究報(bào)道較少,可能是將來研究的重點(diǎn)。此外,參與泌乳素瘤侵襲行為的還有基質(zhì)金屬蛋白酶[28]和芳香化酶細(xì)胞色素 P450[29],它們與GPER1的關(guān)系有待研究。

由于泌乳素腺瘤女性患者多見,為了排除性別的干擾,我們將性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比,結(jié)果表明侵襲組及非侵襲組GPER1的表達(dá)與性別無關(guān)。我們還對(duì)比了年齡、瘤體大小以及術(shù)前血清泌乳素水平對(duì)GPER1基因表達(dá)的影響,最后證實(shí)GPER1基因表達(dá)僅與垂體瘤侵襲性有關(guān),與其他臨床特征無關(guān)。

本研究按照GPER1 mRNA水平分組,校正年齡和腫瘤大小之后發(fā)現(xiàn),不同表達(dá)水平的GPER1對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的影響并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種結(jié)果可能是由于泌乳素垂體瘤并不是惡性程度高的腫瘤,復(fù)發(fā)率不高,結(jié)局發(fā)生數(shù)較少造成的,需要在大樣本人群隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究存在一定的局限性。本文僅研究了泌乳素腺瘤GPER1基因的表達(dá),未對(duì)和侵襲性作用相關(guān)的其他蛋白質(zhì)進(jìn)行更全面的研究和對(duì)比。無法通過多變量分析充分調(diào)查泌乳素瘤侵襲的危險(xiǎn)因素。

目前泌乳素腺瘤的手術(shù)治療及隨訪仍存在很大的挑戰(zhàn)。因此研究更為敏感的生物標(biāo)志物如GPER1為評(píng)判泌乳素垂體瘤的侵襲性和泌乳素垂體瘤的綜合治療提供科學(xué)依據(jù)。