不同擇伐方式下云南松群體遺傳多樣性SSR分析

許玉蘭，汪夢(mèng)婷，蔡年輝，王亞楠

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

【研究意義】遺傳多樣性是生物多樣性的重要方面，也是森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)策略制定與評(píng)價(jià)中的重要參數(shù)[1]，對(duì)保護(hù)資源和合理利用有重要意義[2]，多采用形態(tài)、細(xì)胞學(xué)、生化和分子標(biāo)記進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中分子標(biāo)記是基于DNA多態(tài)性而建立起來(lái)的標(biāo)記形式，以SSR標(biāo)記即微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用較為廣泛[3-4]，該方法在云南松群體遺傳多樣性的評(píng)價(jià)中也得到應(yīng)用[5]。云南松是中國(guó)西南地區(qū)重要的造林樹種，但是，云南松林多為純林，其林分穩(wěn)定性和生產(chǎn)力下降[6]。云南松純林中的許多個(gè)體表現(xiàn)為低矮、彎曲扭曲等，導(dǎo)致林分質(zhì)量下降和遺傳品質(zhì)退化[7]，勢(shì)必會(huì)影響云南松林分應(yīng)有效益的發(fā)揮。因此，開展擇伐對(duì)提高林分質(zhì)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有的研究多集中在林分結(jié)構(gòu)和林木生長(zhǎng)方面，研究表明，撫育間伐可促進(jìn)林木的胸徑生長(zhǎng)和樹高生長(zhǎng)[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】擇伐因保留種質(zhì)不同，可能對(duì)林分的遺傳結(jié)構(gòu)造成影響，分析不同擇伐條件下遺傳多樣性變化對(duì)于確定合理的撫育管理措施具有重要實(shí)踐意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用SSR分子標(biāo)記分析技術(shù)，通過(guò)對(duì)比留優(yōu)去劣、無(wú)人為擇伐、伐優(yōu)留劣3種不同擇伐方式的云南松群體遺傳多樣性變化，及群體遺傳變異特征，揭示它們的遺傳多樣性水平、遺傳關(guān)系以及遺傳分化。以期為云南松的經(jīng)營(yíng)管理提供指導(dǎo)。

表1 云南松采樣群體的地理位置[13]

1 材料與方法

1.1 材料

樣地選擇在云南省雙江縣境內(nèi)，按“留優(yōu)去劣”、“無(wú)人為擇伐”和“伐優(yōu)留劣”不同擇伐方式各設(shè)置1個(gè)樣地(30 m×30 m)[11]。2015年11月進(jìn)行調(diào)查和采樣，采集樣地中每株云南松樹冠中上部位兩年生針葉，用自封袋保存并進(jìn)行單株編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用，每個(gè)樣地的植株數(shù)100～200株[11-13]。后述分析中，以每一種擇伐方式的樣地作為一個(gè)群體。樣本采集信息詳見表1。

1.2 DNA提取與SSR-PCR擴(kuò)增

云南松針葉DNA的提取采用4×CTAB提取法[14-15]。SSR引物信息、SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)同前期研究[12-13,16]，15對(duì)引物分別為PtTX2123[17]、PtTX2146[17]、PtTX3118[18]、PtTX3127[18]、Pr001[19]、PyMR05[20]、PyMR06[20]、PyMR08[20]、PyTr06[21]、PyTr09[21]、PyTr19[21]、PyTr20[21]、PyTr26[21]、PyTr28[21]、PyTr31[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的收集與分析同前期研究[5,11,13]，采用GeneMarker V2.2.0收集數(shù)據(jù)、采用Convert l.3.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換、采用GenALEx 6.4和Arlequin 3.0進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳分化的分析。根據(jù)遺傳距離，采用NTSYSpc 2.10s軟件中的算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對(duì)法，構(gòu)建UPGMA聚類圖。

表2 不同位點(diǎn)擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)

表3 云南松群體的遺傳多樣性

2 結(jié)果與分析

2.1 不同位點(diǎn)擴(kuò)增分析

如表2所示，15對(duì)引物共檢測(cè)74個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)4.911個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)波動(dòng)于1.004(PyMR05)～4.611(PtTX2146)，平均每個(gè)位點(diǎn)2.121個(gè)有效等位基因。Shannon’s信息指數(shù)為0.012(PyMR05)～1.765(PtTX2146)。觀測(cè)雜合度為0.004～0.833、期望雜合度為0.004～0.782，平均分別為0.285和0.423，各位點(diǎn)的擴(kuò)增效果有所不同，以位點(diǎn)PtTX2146擴(kuò)增的多態(tài)性較高。

F統(tǒng)計(jì)量分析(表2)可知，F(xiàn)IS在位點(diǎn)PyMR05和PyMR06表現(xiàn)為負(fù)值，其余位點(diǎn)均表現(xiàn)為正值，平均值為0.368(>0)，存在一定程度的偏離Hardy-Weinberg平衡，且在群體內(nèi)個(gè)體間表現(xiàn)為雜合子缺失；FIT在PyMR05和PyMR06位點(diǎn)中表現(xiàn)為負(fù)值，其余位點(diǎn)均表現(xiàn)為正值，平均值為0.375(>0)，同樣存在一定程度的偏離Hardy-Weinberg平衡，并表現(xiàn)為雜合子缺失。群體間遺傳分化系數(shù)FST為0.001(PyTr28)～0.037(Pr001)，平均值為0.012，即群體間存在1.2 %的遺傳變異，而98.8 %的遺傳變異存在于群體內(nèi)，說(shuō)明云南松變異主要來(lái)源于群體內(nèi)?；蛄髟诓煌稽c(diǎn)的變化為6.495～173.409，位點(diǎn)間差異較大，各位點(diǎn)間平均基因流為35.316，表明它們之間的基因流動(dòng)頻繁。

2.2 云南松群體的遺傳多樣性分析

對(duì)云南松群體的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行估算(表3)，等位基因數(shù)為4.600～5.267，平均為4.911；有效等位基因數(shù)2.061～2.195，平均為2.121，其中留優(yōu)去劣群體(P1)的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)最高，分別為5.267和2.195，伐優(yōu)留劣群體(P3)的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)最低，分別為4.600和2.061。各群體間的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)差異較小，均表現(xiàn)較高水平。觀測(cè)雜合度波動(dòng)于0.272～0.305，期望雜合度波動(dòng)于0.412～0.440，平均值分別為0.285和0.423，各群體間差異較小，均表現(xiàn)為期望雜合度稍高于觀測(cè)雜合度，表明3個(gè)群體的雜合子缺失。3個(gè)群體Shannon’s信息指數(shù)的變化范圍為0.791～0.871，平均為0.819，各群體的Shannon’s信息指數(shù)差異很小(0.080)，表現(xiàn)為：P1>P3>P2。在3個(gè)群體中，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為93.33 %～100.00 %，P1為100.00 %。3個(gè)群體檢測(cè)到的私有基因波動(dòng)為3～10個(gè)，留優(yōu)去劣群體(P1)最多，伐優(yōu)留劣群體(P3)最少。各群體的固定指數(shù)(F)介于0.299～0422，平均為0.374。整體來(lái)看，3個(gè)群體的遺傳多樣性都非常接近，且其多態(tài)性位點(diǎn)百分率較高，遺傳多樣性豐富。綜合比較各個(gè)遺傳參數(shù)值的大小，伐優(yōu)留劣群體(P3)的遺傳多樣性較低，留優(yōu)去劣群體(P1)的遺傳多樣性較高，但它們之間的差異均較小，即云南松群體遺傳多樣性對(duì)不同擇伐方式的響應(yīng)不明顯。

2.3 云南松群體的遺傳分化

對(duì)云南松成對(duì)群體間的遺傳分化系數(shù)進(jìn)行估算(表4)。結(jié)果表明，F(xiàn)ST值介于0.008～0.013，平均值為0.010，F(xiàn)ST值在無(wú)人為擇伐群體(P2)和伐優(yōu)留劣群體(P3)之間最大、在留優(yōu)去劣群體(P1)和其它群體之間較小。比較各成對(duì)群體間的FST值均小于0.05，說(shuō)明群體間的遺傳分化很小[22]。相應(yīng)的，成對(duì)群體間的基因流介于19.701～32.288，平均為27.627，各成對(duì)群體間的基因流遠(yuǎn)大于1，各成對(duì)群體間的基因流強(qiáng)度大、頻率高，削弱群體間遺傳分化。

表4 云南松群體的分化系數(shù)和基因流

注：對(duì)角線以下為FST；對(duì)角線以上為Nm。群體信息詳見表1。

Note:FSTvalues below diagonal,Nm values above diagonal. Populations are described in table 1.

表5 云南松群體間和群體內(nèi)分子方差分析

為進(jìn)一步探明云南松群體的遺傳變異的分布情況，采用Arlequin3.0軟件對(duì)云南松群體進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)(表5)。變異分量百分比表明云南松所有群體總體的遺傳變異主要分布于群體內(nèi)(98.45 %)，而群體間的遺傳變異只占1.55 %，揭示了云南松群體內(nèi)的變異是其變異的主要來(lái)源。

2.4 云南松群體的遺傳距離及其聚類

為進(jìn)一步比較云南松群體間的遺傳關(guān)系，用GenALEx6.4軟件計(jì)算云南松成對(duì)群體間的遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)(表6)。各成對(duì)群體間的遺傳一致度為0.981～0.989，平均0.985，遺傳一致度的最小值在無(wú)人為擇伐群體(P2)和伐優(yōu)留劣群體(P3)之間，最大值在留優(yōu)去劣群體(P1)和無(wú)人為擇伐群體(P2)之間。但是，總體來(lái)看，各成對(duì)群體間的遺傳一致度和遺傳距離差異都非常小，整體表現(xiàn)為群體間遺傳一致度高，遺傳距離低。

基于遺傳距離進(jìn)行算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對(duì)法(UPGMA)聚類分析(圖1)。當(dāng)閾值約為0.016時(shí)，可把3個(gè)云南松群體分為2個(gè)類群，即留優(yōu)去劣群體(P1)和無(wú)人為擇伐群體(P2)聚為一類，伐優(yōu)留劣群體(P3)為一個(gè)類。當(dāng)閾值約為0.011時(shí)，留優(yōu)去劣群體(P1)和無(wú)人為擇伐群體(P2)又各為一個(gè)類。整體來(lái)看，各群體間的遺傳距離小，說(shuō)明各群體在擇伐方式上無(wú)明顯的遺傳分化。

表6 云南松群體間遺傳一致度和遺傳距離

Table 6 Genetic identity and genetic distance among populations ofPinusyunnanensis

群體PopulationP1P2P3P1-0.9890.987P20.011-0.981P30.0140.019-

注：對(duì)角線以下為遺傳距離；對(duì)角線以上為遺傳一致度。

Note: Genetic distance is listed below diagonal and genetic identity is listed and above diagonal.

3 討 論

運(yùn)用的15對(duì)SSR引物表達(dá)出較為豐富的遺傳多態(tài)性，在檢測(cè)的3個(gè)群體中，等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)平均分別為4.911和2.121，觀測(cè)雜合度和期望雜合度波動(dòng)于0.272～0.305和0.412～0.440，平均值分別為0.285和0.423，此值遠(yuǎn)大于Vendramin等[23]所提出的遺傳衰退臨界值(H﹤0.05)。3個(gè)群體中，Shannon’s信息指數(shù)的變化為0.791～0.871，平均為0.819。多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.33 %～100.00 %，平均為95.56 %，總體來(lái)看，云南松群體的遺傳多樣性豐富。比較留優(yōu)去劣群體、無(wú)人為擇伐群體和伐優(yōu)留劣群體的各項(xiàng)遺傳參數(shù)，它們無(wú)明顯變化。因此，云南松遺傳多樣性與擇伐方式間無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)性，以留優(yōu)去劣擇伐方式的云南松群體的遺傳多樣性稍高。

通過(guò)F統(tǒng)計(jì)量分析可知，F(xiàn)IS平均值為0.368，F(xiàn)IT平均值為0.375，說(shuō)明無(wú)論是在整體水平上還是群體內(nèi)個(gè)體間，云南松群體都表現(xiàn)為雜合子缺失現(xiàn)象；FST平均值為0.012，表明云南松群體遺傳變異主要來(lái)源于群體內(nèi)(98.8 %)，群體間的遺傳分化很小。分子方差分析(Molecular AMOVA)也表明，云南松群體的遺傳變異主要存在群體內(nèi)(94 %)，群體間的遺傳變異很小(1 %)，與前期研究報(bào)道相似[5]。云南松成對(duì)群體的基因流平均為27.627，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1，云南松的分布范圍十分廣泛，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，但是云南松是典型的風(fēng)媒傳粉植物，花粉具有氣囊，借助氣流可以遠(yuǎn)距離傳播，它的種子有種翅，傳播距離遠(yuǎn)，從而加強(qiáng)了群體間的基因交流、削弱群體間的遺傳分化。

圖1 基于遺傳距離的不同擇伐方式云南松群體的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of Pinus yunnanensis populations sampled from different logging modes based on genetic distance

不同擇伐方式的云南松群體遺傳分化不明顯，但是留優(yōu)去劣擇伐方式的云南松群體的遺傳多樣性高于其余2個(gè)群體，在聚類圖中也區(qū)別于伐劣留優(yōu)群體。其遺傳分化不明顯一部分原因可能是由于云南松生物特性導(dǎo)致的基因互滲引起的。綜上分析，無(wú)人為擇伐群體與伐優(yōu)留劣群體遺傳距離稍遠(yuǎn)，在個(gè)別遺傳參數(shù)上伐優(yōu)留劣群體大于無(wú)人為擇伐群體。因此，擇伐在一定程度上會(huì)誘導(dǎo)遺傳多樣性的變化，前人研究報(bào)道表明，擇伐后可調(diào)整林分結(jié)構(gòu)[8-9]，激發(fā)土壤微生物活性，加速土壤養(yǎng)分循環(huán)，促進(jìn)林木生長(zhǎng)[10]。同時(shí)云南松群體生境的異質(zhì)性是云南松群體遺傳變異豐富的重要原因，要重視對(duì)云南松群體周圍生境的保護(hù)，同時(shí)避免伐優(yōu)留劣逆向選擇的方式，進(jìn)而保護(hù)云南松群體遺傳多樣性。當(dāng)然，云南松林的間伐還受間伐強(qiáng)度、間伐始期、次數(shù)等的影響[8-9]，對(duì)其遺傳多樣性的影響也是長(zhǎng)期的，可進(jìn)一步開展相應(yīng)研究。

4 結(jié) 論

不同擇伐方式的云南松群體遺傳多樣性豐富，各群體間的遺傳分化低，基因流較高，云南松群體的變異主要來(lái)源于群體內(nèi)，不同擇伐方式對(duì)云南松群體遺傳多樣性的影響不明顯，但是留優(yōu)去劣擇伐方式的云南松群體的遺傳多樣性稍高于其余2個(gè)群體。因此，生產(chǎn)中可對(duì)林分適度擇伐，且保留優(yōu)質(zhì)木。研究結(jié)果可為云南松群體遺傳多樣性保護(hù)與利用的改良策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。