圓弧青霉發(fā)酵右旋糖酐酶過(guò)程動(dòng)力學(xué)模型的建立

黃瑞杰，藍(lán)平，鐘磊，覃琴，藍(lán)麗紅，韋佳蔓，廖安平，李媚

(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料及改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西民族大學(xué))，廣西 南寧，530006)

右旋糖酐酶(dextranase)是由微生物產(chǎn)生用來(lái)降解右旋糖酐中的α-1，6糖苷鍵，使右旋糖酐鏈縮短、分子質(zhì)量降低的酶類(lèi)[1]。內(nèi)切型的右旋糖酐酶隨機(jī)水解右旋糖酐的α-1，6糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是異麥芽糖、異麥芽三糖和低聚異麥芽糖以及系列中低分子質(zhì)量的多糖[2]。內(nèi)切型的右旋糖酐酶在食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[3-5]。右旋糖酐酶法可取代傳統(tǒng)的酸解法降解右旋糖酐，降低能耗、減輕污染，得到均一性好、雜質(zhì)少的特定分子質(zhì)量的右旋糖酐產(chǎn)品[6]。在諸多右旋糖酐酶產(chǎn)生菌中，青霉菌來(lái)源的右旋糖酐酶酶活力高、溫度耐受性好、pH適用范圍寬[7-8]，青霉菌類(lèi)右旋糖酐酶具有極高的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外對(duì)于菌體發(fā)酵右旋糖酐酶的研究主要集中在菌種篩選[9]、發(fā)酵培養(yǎng)基[10]和培養(yǎng)條件[11-12]的優(yōu)化、右旋糖酐酶的純化[13-14]和酶學(xué)性質(zhì)[15-17]等方面，對(duì)菌體發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)的研究和報(bào)道較少[18]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究?？疾彀l(fā)酵過(guò)程中菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活以及總糖(底物)質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化，選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)力學(xué)模型對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行擬合，獲得圓弧青霉發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)此模型進(jìn)行誤差分析，為圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及大型反應(yīng)器設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

右旋糖酐T70(Mw≈70 kDa)(分析純)，damas-beta試劑公司；98%濃硫酸(分析純)，成都市科隆化學(xué)有限公司；蒽酮(分析純)，aladdin試劑公司；圓弧青霉(P.cyclopium，CICC-4022)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30、NaNO33、KCl 0.5、 MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO41.0，pH 6.0～6.2；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：右旋糖酐30、酵母膏4、ρ(KCl)∶ρ(FeSO4·7H2O)=10∶1、K2HPO41.0， pH 6.0。

1.2 材料與儀器

LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)； LT-XT搖床，瑞士Kuhner AG；ACB-4A1垂直流超凈工作臺(tái)，新加坡藝思高科技有限公司；SZ-97自動(dòng)三重二次蒸餾水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；THS-15數(shù)控超級(jí)恒溫槽，寧波天恒儀器廠(chǎng)；UV-4802H雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；H1850R冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液制備

裝液量60 mL、接種量3%、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 6.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下恒溫培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液于10 000 r/min，4 ℃離心20 min后，取上清液即得粗酶液，稀釋數(shù)倍供酶活和總糖質(zhì)量濃度測(cè)定使用。

1.3.2 菌體質(zhì)量濃度的測(cè)定

用干重法測(cè)定菌體干重，將發(fā)酵液離心后抽濾得到菌體，用蒸餾水洗3次，于80 ℃的烘箱中烘干至恒重，用分析天平測(cè)定濾紙前后的質(zhì)量差即為菌體干重m(g)。根據(jù)菌體質(zhì)量與發(fā)酵液體積(60 mL)計(jì)算菌體質(zhì)量濃度ρ(g/L)，如公式(1):

(1)

1.3.3 右旋糖酐酶酶活測(cè)定

取1 mL質(zhì)量濃度為30 g/L的右旋糖酐T70(0.02 mol/L， pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制)預(yù)熱后與1 mL稀釋過(guò)的粗酶液混勻，置于50 ℃恒溫水浴保溫10 min，反應(yīng)結(jié)束取1 mL反應(yīng)液于25 mL的具塞試管中，加入1 mL DNS試劑后，沸水浴后冷卻定容，在540 nm處測(cè)定吸光度值，以同等條件下沸水浴10 min 滅活的酶液作為對(duì)照，計(jì)算酶活，如公式(2)所示。右旋糖酐酶的酶活用水解底物產(chǎn)生的還原糖的量來(lái)表示。右旋糖酐酶酶活力定義為：在pH 5.0、50 ℃，每小時(shí)水解右旋糖酐T70釋放出1 mg還原糖(葡萄糖當(dāng)量)為1個(gè)酶活單位(U)[19]。

右旋糖酐酶活/(U·mL-1)=

(2)

1.3.4 總糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用蒽酮硫酸法測(cè)總糖質(zhì)量濃度[20]。

1.3.5 發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)的繪制

進(jìn)行圓弧青霉的發(fā)酵培養(yǎng)，從接種時(shí)起，每隔8 h取樣，采用1.3.2、1.3.3、1.3.4的方法進(jìn)行圓弧青霉菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活和右旋糖酐的質(zhì)量濃度的測(cè)定，分別得到圓弧青霉菌體生長(zhǎng)、右旋糖酐酶生成和總糖消耗的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用Origin 8.0軟件制作圓弧青霉發(fā)酵右旋糖酐酶的過(guò)程曲線(xiàn)。

1.3.6 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

1.3.6.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型有Monod方程，Tessier方程，Contois方程，Moser方程和Logistic方程[21]。采用Logistic方程建立菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型表示圓弧青霉菌體質(zhì)量濃度與時(shí)間的關(guān)系。Logistic方程如公式(3)：

(3)

式中：X表示菌體質(zhì)量濃度，g/L；μmax表示最大比生長(zhǎng)速率，h-1； Xmax表示最大菌體質(zhì)量濃度，g/L；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

當(dāng)t=0時(shí)，X=X0，X0(g/L)為初始菌體質(zhì)量濃度，對(duì)公式(3)積分得公式(4)：

(4)

1.3.6.2 右旋糖酐酶生成動(dòng)力學(xué)模型的建立

選用Leudeking-Piret方程來(lái)擬合菌體產(chǎn)酶的過(guò)程。

Leudeking-Piret方程為公式(5)：

(5)

式中：P為右旋糖酐酶酶活，U/mL；α為與菌體生長(zhǎng)率相關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù)；β是非伴隨菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù)。

產(chǎn)物合成與菌體生長(zhǎng)有偶聯(lián)型、部分偶聯(lián)型、非偶聯(lián)型。α≠0，β=0，產(chǎn)物與菌體生長(zhǎng)屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型；α=0，β≠0，為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型；α≠0，β≠0，為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型[22]。當(dāng)產(chǎn)菌體生長(zhǎng)于產(chǎn)物生成是偶聯(lián)型時(shí)，α≠0，β=0。

將公式(3)帶入公式(5)得公式(6)：

(6)

將公式(6)積分得公式(7)。

(7)

1.3.6.3 右旋糖酐消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立

選用類(lèi)Leudeking-Piret方程用來(lái)描述發(fā)酵過(guò)程中底物消耗的過(guò)程。

類(lèi)Leudeking-Piret方程如公式(8):

(8)

式中:S為發(fā)酵液中總糖質(zhì)量濃度,g/L；m為維持菌體新陳代謝因數(shù),s-1；YX/S為相對(duì)于底物消耗的菌體得率系數(shù)；YP/S為相對(duì)于底物消耗的產(chǎn)物得率系數(shù)。

碳源消耗主要用于菌體生長(zhǎng)和右旋糖酐酶的誘導(dǎo)合成時(shí)，用來(lái)維持細(xì)胞生理活動(dòng)所需消耗的底物較小，可以忽略[23]，即m=0。右旋糖酐消耗動(dòng)力學(xué)模型可表示為公式(9):

(9)

式中:k1代表用于菌體生長(zhǎng)的底物消耗常數(shù)，k2代表用于產(chǎn)物形成的底物消耗常數(shù)。

將公式(9)積分得公式(10):

(10)

式中，S0為發(fā)酵液中總糖初始質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓弧青霉發(fā)酵過(guò)程研究

按照1.3.5方法得到發(fā)酵過(guò)程中圓弧青霉生長(zhǎng)、右旋糖酐酶生成以及右旋糖酐消耗的曲線(xiàn)，如圖1所示。

圖1 菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活、右旋糖酐質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化Fig.1 Changes of cell mass concentration, dextranase activity and dextran mass concentration with time

由圖1可知，接種初期圓弧青霉菌(CICC-4022)生長(zhǎng)緩慢，隨后生長(zhǎng)速率逐漸增大，最后趨于穩(wěn)定。0～40 h處于生長(zhǎng)延滯期，圓弧青霉菌在這一時(shí)期生長(zhǎng)速度較慢，幾乎不產(chǎn)右旋糖酐酶，底物消耗的較少；40～72 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，圓弧青霉菌體繁殖速度加快，菌體質(zhì)量濃度增加，右旋糖酐酶大量產(chǎn)生，底物被大量消耗；發(fā)酵72～120 h，圓弧青霉菌的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體繁殖緩慢并逐漸呈現(xiàn)死亡狀態(tài)，右旋糖酐酶合成速度減慢，圓弧青霉質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶都處于相對(duì)平衡狀態(tài)，變化較小。由圖1可知產(chǎn)酶和菌體生長(zhǎng)密切相關(guān)，基本同步，說(shuō)明圓弧青霉(CICC-4022)發(fā)酵右旋糖酐酶的過(guò)程屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型。

2.2 圓弧青霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

由圖1可知，圓弧青霉的生長(zhǎng)曲線(xiàn)接近于S型曲線(xiàn)，Logistic方程是一個(gè)典型的S型方程[24-25]， Logistic方程適用于擬合圓弧青霉的生長(zhǎng)過(guò)程。

Logistic方程的積分式為公式(4)。式中X0=0.003 3 g/L。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合得出參數(shù)值；μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L。

圓弧青霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為公式(11):

(11)

2.3 右旋糖酐酶生成動(dòng)力學(xué)模型

選用Leudeking-Piret方程來(lái)擬合菌體產(chǎn)酶的過(guò)程。由圖1可知，圓弧青霉發(fā)酵過(guò)程中，右旋糖酐酶的生成與菌體生長(zhǎng)基本同步，因此圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的過(guò)程屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，α≠0，β=0。

Leudeking-Piret方程的積分式為公式(7)。式中X0=0.003 3 g/L，μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合得出參數(shù)值，α=6.325 1。

圓弧青霉發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的動(dòng)力學(xué)模型為公式(12):

(12)

2.4 右旋糖酐消耗動(dòng)力學(xué)模型

右旋糖酐是圓弧青霉發(fā)酵過(guò)程中的唯一碳源，主要用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)、菌體新陳代謝和誘導(dǎo)產(chǎn)物的合成[24]。通過(guò)菌體發(fā)酵過(guò)程中的底物消耗曲線(xiàn)可知，類(lèi)Leudeking-Piret方程可以用來(lái)描述發(fā)酵過(guò)程中底物消耗的過(guò)程。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。

類(lèi)Leudeking-Piret方程的積分式為公式(10)。式中S0=33.269 6 g/L，X0=0.003 3 g/L，μmax=0.128 3 h-1，Xmax=9.551 7 g/L，α=6.325 1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 8.0擬合的出參數(shù)：k1=1.186 8，k2=0.056 8。

發(fā)酵過(guò)程中底物消耗動(dòng)力學(xué)模型為公式(13):

(13)

表1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameter values in kinetic models of fermentation

2.5 擬合曲線(xiàn)分析

根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、右旋糖酐酶生成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型，應(yīng)用Origin 8.0得到圓弧青霉發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(xiàn)Fig.2 Cell growth kinetics model fitting curve

圖3 右旋糖酐酶生成動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(xiàn)Fig.3 Dxtranase production kinetics model fitting curve

圖4 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(xiàn)Fig.4 Dextran consumption kinetic mobel fitting curve

菌體質(zhì)量濃度、右旋糖酐酶酶活和總糖質(zhì)量濃度的實(shí)測(cè)值、計(jì)算值相對(duì)誤差如表2所示。

圖2～圖4分別為圓弧青霉生長(zhǎng)、右旋糖酐酶生成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型的擬合曲線(xiàn)，菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、右旋糖酐酶生成動(dòng)力學(xué)和底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合度相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994、0.992、0.991，說(shuō)明這3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型可很好地反映菌體生長(zhǎng)、右旋糖酐酶生成和底物消耗的過(guò)程。

由表2可知，40 h之前菌體質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶酶活相對(duì)誤差較大，基本>20%，可能是因?yàn)榫w處于生長(zhǎng)停滯期，菌體質(zhì)量濃度和右旋糖酐酶酶活數(shù)值上較小，造成較大的實(shí)驗(yàn)測(cè)量誤差[23-24]；40 h之后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體質(zhì)量濃度與右旋糖酐酶活逐漸增大，測(cè)量誤差較小，相對(duì)誤差隨之減小，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。發(fā)酵過(guò)程中總糖消耗相對(duì)誤差全部<7%，擬合良好，主要是因?yàn)榭偺窃谘芯康陌l(fā)酵過(guò)程中消耗較少，測(cè)量誤差較小。總的來(lái)說(shuō)，發(fā)酵過(guò)程中的3條曲線(xiàn)可以較好地反映圓弧青霉的生長(zhǎng)、右旋糖酐酶的產(chǎn)生和總糖消耗的規(guī)律。

表2 菌體質(zhì)量濃度、酶活、總糖質(zhì)量濃度實(shí)測(cè)值與計(jì)算值的比較Table 2 Comparison between experimental and predicted values of cell mass concentration，dextranase activity，total sugar mass concentration

3 結(jié)論

通過(guò)以上動(dòng)力學(xué)研究可以看出，圓弧青霉菌的比生長(zhǎng)速率、右旋糖酐酶的比生成速率在整個(gè)發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程是隨時(shí)間變化的，圓弧青霉的比生長(zhǎng)速率的最大值和右旋糖酐酶比生成速率的最大值均出現(xiàn)在菌體由延滯期向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的過(guò)渡期。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以結(jié)合該試驗(yàn)得出的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)生產(chǎn)進(jìn)行監(jiān)控，并可以考慮在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高右旋糖酐酶的產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率。